摘要：【目的】构建硒结合蛋白1基因(SBP1)过表达与干扰重组慢病毒载体,并通过感染猪骨骼肌卫星细胞验证SBP1基因的过表达和沉默效果,为后续揭示SBP1基因调控肌纤维类型转化及猪肉品质的分子机理打下基础。【方法】在对猪SBP1蛋白进行生物信息学分析的基础上,根据GenBank中猪SBP1基因mRNA序列(XM_021089863.1)PCR扩增SBP1基因全长序列,克隆至过表达慢病毒载体pHBLV-CMV上构建SBP1基因过表达重组慢病毒载体;同时针对猪SBP1基因设计3个干扰靶点序列和1个阴性对照序列,分别克隆至干扰慢病毒载体pHBLV-U6上构建SBP1基因干扰重组慢病毒载体。以构建的重组慢病毒载体感染猪骨骼肌卫星细胞,经嘌呤霉素筛选获得稳定表达细胞系,并采用实时荧光定量PCR和Western blotting检测SBP1基因及其蛋白的表达情况。【结果】猪SBP1蛋白分子式为C_(2523)H_(3916)N_(678)O_(727)S_(24),相对分子量为56.14839 kD,理论等电点(pI)为6.40,为稳定的分泌蛋白;存在39个潜在磷酸化位点,包括20个丝氨酸磷酸化位点、6个酪氨酸磷酸化位点及13个苏氨酸磷酸化位点。以构建的SBP1基因过表达与干扰重组慢病毒载体分别感染猪骨骼肌卫星细胞,经嘌呤霉素筛选2代后,在荧光显微镜下均能观察到绿色荧光。实时荧光定量PCR检测结果表明,过表达组的SBP1基因相对表达量极显著上调32.0倍(P<0.01,下同),干扰组中以shRNA-3的沉默效果达极显著水平,对应的SBP1基因相对表达量下调58.45%;Western blotting检测结果显示,过表达组的SBP1蛋白表达量极显著上调,而shRNA-1、shRNA-2和shRNA-3干扰组的SBP1蛋白表达量均极显著下调。【结论】基于猪骨骼肌卫星细胞成功构建了猪SBP1基因过表达稳定表达细胞系,同时鉴定出shRNA-3对SBP1基因的沉默效果最佳并获得稳定沉默细胞系,为后续揭示SBP1基因调控猪肉品质的分子机理打下了基础。

摘要：目的慢病毒载体技术已被广泛应用于基因功能分析、信号转导通路和基因治疗的研究。文中应用慢病毒系统构建凋亡抑制基因Bi-1的慢病毒表达载体并检测其在NIH3T3细胞中的表达,为后续的以Bi-1基因为靶点的肿瘤基因治疗研究奠定基础。方法根据慢病毒表达载体酶切位点的特征序列设计PCR扩增引物并扩增人Bi-1 cDNA,并采用DNA重组技术定向克隆至pLCMV-IG质粒中,构建重组慢病毒载体质粒pLCMV-IG-Bi-1,经PCR、双酶切和测序鉴定后,包装慢病毒感染至小鼠成纤维细胞株NIH3T3中,RT-PCR及Western-blot分别检测NIH3T3细胞中Bi-1基因和蛋白的表达。结果 PCR、酶切及测序结果表明重组慢病毒载体构建成功;NIH3T3细胞感染重组载体包装的慢病毒后出现明显的Bi-1基因高表达。结论成功构建靶向Bi-1基因的重组慢病毒载体,为进一步研究Bi-1基因对细胞生长转化的影响提供了实验依据。

摘要：目的 构建微小RNA-206（miR-206）的慢病毒载体转染MCF-7细胞,观察转染效率和细胞生物学特性的改变.方法 针对miR-206有效的靶序列设计合成寡链DNA,经过退火、连接、聚合酶链反应（PCR）筛选、测序鉴定、慢病毒包装、共转染等步骤获得慢病毒LV-hsa-miR-206,将其转染MCF-7细胞,实时定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）检测miR-206表达,细胞计数试剂盒（CCK-8）法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期.结果 PCR扩增出插入片段,目的基因的测序结果与GeneBank序列一致.感染慢病毒后,MCF-7的miR-206表达由1.000增加至120.331±1.801;细胞增殖能力显著降低,在转染后第2天由1.420±0.052降低为1.275±0.147,第3天由1.762±0.089降低为1.387±0.093,第4天由2.045±0.235降低为1.269±0.103,凋亡细胞和G2期细胞比例显著增加.结论 成功构建LV-hsa-miR-206慢病毒载体,并在MCF-7细胞中成功表达,miR-206表达水平增加导致细胞的生物学特性发生明显变化.

摘要：目的探讨慢病毒介导的CXCR7-shRNA转染人结肠癌细胞株SW620后对CXCR7蛋白表达的影响。方法①设计并合成CXCR7的3对shRNA序列及1对阴性对照序列,与pSilencerTM4.1系统合成构建重组慢病毒载体,转染HEK293T细胞包装病毒并检测滴度;②将3种重组慢病毒载体及阴性对照分别感染人结肠癌细胞SW620,RT-PCR检测CXCR7mRNA的表达情况,测定沉默效率,筛选沉默效率最高的一组CXCR7-shRNA作为后续实验的表达载体;③MTT法检测转染CXCR7-shRNA对SW620细胞生长增殖的影响;④细胞划痕实验检测转染CXCR7-shRNA对SW620细胞侵袭迁移能力的影响;⑤Western blot检测转染CXCR7-shRNA对SW620细胞蛋白表达情况。结果①测序证实3对慢病毒载体及1对阴性对照载体均包装成功,滴度分别3.16×108pfu/mL、4.27×108 pfu/mL、3.93×108pfu/mL和2.95×108pfu/mL;②3组慢病毒载体转染SW620细胞后,CXCR7mRNA的表达量均较阴性对照组明显降低(P<0.05),其中CXCR7-shRNA-1对CXCR7的抑制率明显高于其他两组(P<0.05);③CXCR7-shRNA-1转染SW620后,肿瘤细胞的增殖程度显著减少,与空白组相比有统计学差异(P<0.05);④SW620细胞在划痕24h后,空白对照组和实验组的细胞迁移指数(MI)分别为(49.92±6.41)%和(29.13±5.38)%,差异有统计学意义(P<0.05),划痕48h后,对照组与实验组的MI分别为(96.52±7.44)%和(72.03±8.29)%,差异有统计学意义(P<0.05);⑤CXCR7-shRNA-1转染SW620细胞后,与空病毒载体组、空白组相比,CXCR7蛋白表达量明显降低,具有统计学意义(P<0.05)。结论 CXCR7被沉默后可有效抑制SW620肿瘤细胞的增殖与迁移,这为后续研究以CXCR7/CXCL12生物学轴为靶点的肿瘤基因治疗打下良好基础。

摘要：目的:探讨慢病毒介导的CXCR7-shRNA转染人结肠癌细胞株SW620后对CXCR7蛋白表达的影响。方法:(1)设计并合成CXCR7的3对shRNA序列及1对阴性对照序列,与pSilencerTM4.1系统合成构建重组慢病毒载体,转染HEK293T细胞包装病毒并检测滴度;(2)将3种重组慢病毒载体及阴性对照分别感染人结肠癌细胞SW620,RT-PCR检测CXCR7 mRNA的表达情况,测定沉默效率,筛选沉默效率最高的一组CXCR7-shRNA作为后续实验表达载体;(3)MTT法检测转染CXCR7-shRNA对SW620细胞生长增殖的影响;(4)通过细胞划痕实验检测转染CXCR7-shRNA对SW620细胞侵袭迁移能力的影响;(5)Western blot检测转染CXCR7-shRNA对SW620细胞蛋白表达情况。结果:(1)测序证实3对慢病毒载体及1对阴性对照载体均包装成功,滴度分别为3.16×108TU/ml、4.27×108TU/ml、3.93×108TU/ml和2.95×108TU/ml;(2)3组慢病毒载体转染SW620细胞后,CXCR7 mRNA的表达量均较阴性对照组明显降低(P<0.05),其中CXCR7-shRNA-1对CXCR7的抑制率明显高于其他两组(P<0.05);(3)CXCR7-shRNA-1转染SW620后,肿瘤细胞的增殖程度显著减少,与空白组相比有显著性差异(P<0.05);(4)SW620细胞在划痕24h后,空白对照组和实验组的细胞迁移指数(MI)分别为(49.92±6.41)%和(29.13±5.38)%,有统计学意义(P<0.05),划痕48h后,对照组与实验组的MI分别为(96.52±7.44)%和(72.03±8.29)%,有统计学意义(P<0.05);(5)CXCR7-shRNA-1转染SW620细胞后,与空病毒载体组、空白组相比,CXCR7蛋白表达量明显降低,具有统计学意义(P<0.05)。结论:CXCR7-shRNA慢病毒表达载体转染SW620细胞后可有效下调CXCR7 mRNA和蛋白的表达水平并能够抑制肿瘤细胞的增殖与迁移,为下一步研究以CXCR7/CXCL12生物学轴为靶点的结直肠癌慢病毒基因沉默治疗打下了良好的基础,为结直肠癌的基因治疗提供了新方向。