摘要：目的:为提高CpG基序重组菌的发酵水平,降低CpG重组质粒的生产成本,运用响应面法优化CpG重组菌发酵培养基。方法:利用Plackett-Burman试验筛选出影响发酵水平的3个最显著因素:糖蜜、玉米浆和工业蛋白胨。然后用响应面设计试验并优化得到最显著因素的最佳浓度,并进一步通过发酵试验验证优化后的培养基。结果:得到一组具有较高菌浓及质粒产量且价格低廉的发酵用培养基:糖蜜4.5g/L,玉米浆8.5g/L,工业蛋白胨8.5g/L,甘油10mL/L,KH2PO41.5g/L,K2HPO42.3g/L,MgSO4.7H2O 0.25g/L,在此培养条件下,OD600实测值为0.6771,理论值为0.6643,两者接近,与标准LB培养基相比,质粒产量提高了15%左右。结论:最终筛选到的培养基具有较高的性价比。

摘要：运用一系列统计学原理和方法,筛选一种适用于抗菌肽重组菌大规模发酵用培养基,以降低重组质粒的生产成本,提高产量。首先用单因子试验筛选出最适碳源和氮源,然后用Plackett-Burman试验筛选出影响菌体产量最显著因素,最后用最陡爬坡试验和响应面试验设计并借助minitable统计分析软件分析数据并建立模型,最终筛选得到一组具有较高菌体和质粒产量的发酵用培养基配方为:糖蜜2.5g/L,玉米浆8.8g/L,国产酵母粉8.6g/L,KH2PO41.5g/L,K2HPO42.3g/L,Mg SO4-7H2O 0.25g/L,甘油10m L/L,优化后的发酵培养基质粒产量提高了2倍,且成本显著降低,具有较高的性价比。

摘要：以透明质酸分解酶基因(Hyl)为改造目标,利用同源重组技术获得Hyl基因敲除的重组菌。首先以兽疫链球菌的基因组DNA为模板扩增出部分透明质酸分解酶基因(Hyl-1),然后将其克隆到载体pMD19-T上,再以质粒pUC19为模板,PCR扩增得到氨苄青霉素抗性基因,通过反向PCR将其插入Hyl-1基因的中部,得到基因敲除载体pMD19T-SA。该载体与质粒pBR322分别用EcoRⅠ、PstⅠ双酶切后进行连接,得到基因敲除的重组载体pBR322-SA,PCR及限制性酶切分析,构建的敲除载体与设计结果相符。最后,利用这两种敲除载体通过同源重组技术得到一株重组菌,经PCR及酶活鉴定,这株菌的Hyl基因已缺失。

摘要：***11是一株能以甲醇为唯一碳源生长的细菌,初步发酵检测发现能转化甘氨酸为L-丝氨酸。QscR基因产物是甲基营养菌中丝氨酸循环的一个转录调控关键因子,根据在GenBank中已报道的QscR基因序列(登录号:NC_012988.1)设计引物,以***11的染色体DNA为模板,利用PCR扩增得到一大小为987 bp的QscR基因,将该基因克隆到广泛宿主载体pLAFR3上,在帮助质粒pRK2013的介导下,利用三亲本结合使其导入到菌株SDM11中构建重组菌株SDM12。对SDM12进一步研究发现,重组菌株中与L-丝氨酸合成相关的关键酶丝氨酸羟甲基还原酶(SHMT)的酶活比野生型菌株SDM11要低,约为野生型菌株的70%左右,另一个酶——羟基丙酮酸还原酶(HPR)的酶活力也只有野生型的75%。进一步将菌株进行产L-丝氨酸研究,结果表明,重组菌的产L-丝氨酸能力也明显降低,约为野生型菌株的67%左右。

摘要：目的对比淡水发光细菌——青海弧菌Q67荧光素酶基因luxAB和luxCDABE在新的表达体系中的表达,为构建特异性检测毒性的重组菌提供基础。方法设计引物扩增得到青海弧菌Q67荧光素酶基因luxAB和luxCDABE,将其分别与表达载体pET-22b连接,转化大肠杆菌DH5α测序,阳性质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)进行表达。检测两种重组菌的发光特性及重金属离子对其毒性影响。结果通过测定重组菌的相对发光强度(RLU)和OD600值可知:luxAB和luxCDABE重组菌在癸醛和IPTG浓度均为1μL/mL培养基里培养第1小时后达到最大RLU,值分别为750618.5和140901.5。检测重金属离子Cd^(2+)、Hg^(2+)、Cr^(6+)对重组菌的毒性,EC_(50)(半有效浓度)值分别为:luxAB重组菌:5.160、5.129、7.097 mg/L;luxCDABE重组菌:6.137、7.643、7.736mg/L。结论在相同培养条件下,luxAB重组菌比luxCDABE重组菌获得了更大的RLU,说明lux AB表达效果更好。重金属对重组菌的毒性影响检测,luxAB重组菌得到了更低的EC_(50)值,进一步论证了这个观点。