摘要：一直以来,人类健康都在承受着病原微生不同程度的威胁,其中肺炎克雷伯菌是常见的条件致病菌之一,当机体免疫力低下时,容易发生炎性病变,从而引起肺炎、尿路感染和败血症等院内感染。综合分析肺炎克雷伯菌的致病特征,认为快速、准确地从患者血液中检出病原菌,对感染患者进行及时的治疗具有重要意义。方法 传统病原微生物的检测有培养法、免疫检测或者生化鉴定等方法,随着分子生物学技术不断发展,使病原微生物的快速和灵敏检测成为了可能,结合我们新型的聚合酶链式反应技术,产生新的实验方法,探讨分析M1磁珠富集联合重组酶介导的聚合酶链式反应技术检测的可行性以及临床样本中病原菌核酸的最优提取方法。结果 在已经建立的PCR方法中的引物作为内引物的基础上,根据RAA的引物设计原则设计RAA反应过程的外引物,筛选出最优引物对,建立RAP的方法和检测技术,预期核酸扩增特异性达到100%,检测下限达到10CFU/mL。结论 分析肺炎克雷伯菌的病原学特征、基因的特点,建立了这套灵敏度高、特异性强、反应迅速可靠的M1磁珠富集联合重组酶介导的聚合酶链式反应技术,使得检测血液样本中的肺炎克雷伯菌更具特异性,有助于发现早期细菌感染患者并给予其及时的治疗,为今后肺炎克雷伯菌的准确诊断提供了新的选择。

摘要：目的建立快速、敏感、特异的逆转录重组酶介导(Reverse-transcription recombinase-aid assay,RT-RAA)核酸检测方法,用于中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-Co V)的检测。方法根据MERS-Co V基因的保守序列设计并合成特异性RAA引物及探针。通过条件优化,以10倍系列稀释经第3代慢病毒载体构建的假病毒颗粒阳性标准品为模板,进行RT-RAA扩增,并进行特异性、敏感性以及临床样本检测。结果建立的RT-RAA方法检测MERS-Co V假病毒颗粒阳性标准品的灵敏度为10拷贝/ml,高于实时荧光RT-PCR方法(10~2拷贝/ml);用该方法检测MERS-Co V假病毒颗粒有明显扩增,而甲型H1N1流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒等4种呼吸道病毒的检测均为阴性;检测我国首例输入性MERS病例的临床样本及1例英国QCMD协会的室间质评阳性灭活样本均能检出,与实际结果相符。检测时间(20 min)大大低于实时荧光RT-PCR(90 min)。结论建立的MERS-Co V RT-RAA检测方法灵敏、特异、快速,可用于MERS-Co V感染的现场快速检测和流行病学调查。

摘要：建立基于重组酶介导的中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）核酸检测方法。本研究设计、合成特异性中东呼吸综合征冠状病毒基因的重组酶介导检测（RAA）引物及探针,制备MERS-CoV假病毒颗粒阳性对照品,通过一系列条件优化建立了MERS-CoV的快速、灵敏、特异的RT-RAA检测方法,分别与荧光定量RT-PCR检测方法做比较,并且采用首例中国MERS-CoV韩国地区输入病例的咽拭子样品、其它类似呼吸道病毒样本以及英国QCMD的MERS-CoV室间质评灭活样本做临床验证。结果显示：建立的RT-RAA方法检测中东呼吸综合征冠状病毒灵敏度为10拷贝,高于本实验室建立的荧光RT-PCR方法灵敏度（100拷贝）,且检测时间（4.8~13.6min）大大低于荧光RT-PCR检测时间（90min）;用该方法检测中东呼吸综合征冠状假病毒颗粒为阳性,而检测其他8种对照呼吸道病毒均呈阴性;检测临床阳性样本也与实际结果相符。本研究建立的中东呼吸综合征冠状病毒RT-RAA检测方法灵敏、特异、快速,可用于中东呼吸综合征冠状病毒感染的现场快速诊断和流行病学调查。