摘要：为了建立一种简单、快速鉴别检测犬瘟热病毒(CDV)野毒株与疫苗株的方法,试验根据Gen-Bank中CDV野毒株与疫苗株H基因序列设计鉴别检测引物,建立鉴别CDV野毒株与疫苗株一步法RT-PCR,并验证该方法的特异性、敏感性、重复性及符合性;利用建立的鉴别CDV野毒株与疫苗株双重一步法RT-PCR检测方法对2017—2020年采集于江苏省11个不同地市的505份发病犬喉拭子样品和病料样品进行检测,确定CDV野毒株与疫苗株双重一步法RT-PCR的临床适用性。结果表明:该方法对CDV野毒株、CDV疫苗株、CDV野毒株/疫苗株可分别扩增出477 bp、677 bp、477 bp/677 bp的特异性条带,而检测犬细小病毒(CPV)、犬腺病毒(CAV)、犬副流感病毒(CPIV)、犬冠状病毒(CCV)均为阴性;该方法的检测灵敏度为23.1 pg RNA;与RFLP方法的符合率为100%;批内重复性检测和批间重复性检测的结果完全一致;利用该方法检测505份临床样品,CDV野毒株和疫苗株的阳性率分别为8.91%和72.48%。说明建立的鉴别CDV野毒株与疫苗株一步法RT-PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性、重复性、准确性和临床适用性。

摘要：为了建立水貂肠炎病毒(MEV)疫苗株与野毒株的鉴别检测方法,根据GenBank中的水貂肠炎病毒序列设计了1对引物,用来扩增包含水貂肠炎病毒NS1基因在内的2 013bp大小的片段。通过对国内疫苗毒MEVB株及其他细小病毒参考株的NS1基因序列比较发现,疫苗毒MEVB株NS1基因核苷酸1401位的碱基由T变为C,致使1399位～1404位的核苷酸构成由ATTGAT变异为ATCGAT,多了1个限制性内切酶ClaⅠ酶切位点,其他MEV分离毒株中均未出现此酶切位点。用特异性引物扩增出2 013bp的目的片段后,再用限制性内切酶ClaⅠ进行酶切分析,疫苗毒MEVB株被切割成1 404bp和609bp的2个片段,国内其他分离株均未出现上述片段。结果表明,所建立的PCR-RFLP方法可以区分疫苗毒MEVB株和野毒株。

摘要：本研究旨在建立一种可视化检测猪瘟病毒(CSFV)野毒株的反转录-环介导等温扩增方法(RT-LAMP)。根据CSFV的NS5B基因序列设计一套RT-LAMP引物,以样品的cDNA为模板,利用BstDNA聚合酶,在62℃恒温条件下进行扩增,扩增产物中加入SYBR GreenⅠ染料直接或在紫外光下观察判定扩增结果。该方法可检测出不同基因型的CSFV野毒株,其检出极限为2.5TCID50的CSFV,与实时荧光定量RT-PCR方法的敏感性相当;特异性试验表明,该方法对猪瘟兔化弱毒疫苗株(HCLV)、牛病毒性腹泻病毒以及其它常见猪源病毒均无扩增反应;通过对126份不同样品进行检测比较,该方法与实时荧光定量RT-PCR检测方法的符合率达100%,与引物-探针能量转移PCR方法的符合率为98.4%。该方法无需特殊仪器,是一种适用于基层的快速、简便的CSFV野毒鉴别检测方法。

摘要：针对伪狂犬病病毒疫苗株基因组缺失的3.5kb片段,设计3套引物和探针,并用标准的伪狂犬病病毒野毒株和疫苗毒株进行测试,建立了一种新的快速鉴别伪狂犬病病毒野毒株和疫苗株的实时荧光定量PCR方法。该方法的检测极限可达10copies/μL,并与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒等不存在交叉反应现象,批内和批间重复性试验的变异系数分别为1.70%±1.07%和2.22%±1.02%,显示该方法具有良好的重复性。在对临床20份样品的检测时,该荧光定量PCR的阳性率为60%,普通PCR的阳性率仅为40%。结果表明,该方法具有特异性高、敏感性强的特点,是一种值得推广的快速诊断技术,可用于猪伪狂犬病的诊断和流行病学调查等。

摘要：为建立伪狂犬病病毒(PRV)野毒株与gE基因缺失疫苗株的鉴别诊断和准确定量的微滴数字PCR(ddPCR)方法,本研究以PRV gD和gE基因为靶基因,设计并合成了2套特异性引物和Taq Man探针,建立了分别针对PRV gD和gE基因的dd PCR方法。结果显示,本研究建立的dd PCR方法能够特异性地鉴别检测PRV野毒株和疫苗株,与圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等均无交叉反应;该方法针对PRV gD、gE基因的检测限分别为3.9拷贝/μL、2.3拷贝/μL,分别比相应的荧光定量PCR (qPCR)方法敏感性高10倍和5倍;针对PRV gD、gE基因的批内和批间重复性试验结果变异系数(C.V)均小于4%;通过对45份临床样品的检测,结果显示,与病毒分离方法相比,dd PCR方法敏感性为91.7%,特异性为97.2%,符合率为97.8%;与dd PCR方法相比,q PCR的敏感性为83.3%,特异性为94.3%,符合率为95.6%。本研究建立的dd PCR方法在检测低拷贝临床样品时敏感性更高、特异性强、重复性好,可以作为PRV野毒株与疫苗株的鉴别、准确定量的有效检测手段。

摘要：为了建立快速、有效的鉴别犬瘟热病毒(CDV)野毒株与疫苗株的诊断方法,根据CDV野毒株与疫苗株N基因的保守区域以及H基因的多变区域设计特异性引物,建立了区分CDV野毒株与疫苗株的联合RT-PCR方法。结果表明,针对N基因的RT-PCR方法能同时检测CDV野毒株与疫苗株;而针对H基因的RT-PCR方法只能检测CDV野毒株,不能检测CDV疫苗株。根据2次RT-PCR反应结果,能够很好地区分CDV野毒株与疫苗株。同时,经过病毒电镜观察和H基因扩增片段的克隆测序结果的比对,进一步确认了该方法的特异性。表明,该方法具有快速、特异、实用等优点,可作为CDV鉴别诊断的有效手段。

摘要：借助计算机软件，在分析比较了９个传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）Ａ片段结构蛋白基因的基础上，设计并合成了２对ＶＰ２和ＶＰ３基因ＰＣＲ引物，经ＲＴ－ＰＣＲ反应条件优化选择，成功地建立了ＲＴ－ＰＣＲ方法，用于扩增ＩＢＤＶＶＰ２和ＶＰ３基因，经琼脂糖凝胶电泳和分子杂交鉴定，获得４个ＩＢＤＶ野毒株ＶＰ２和ＶＰ３基因。

摘要：在本实验中 ,用根据CPVHl标准毒核苷酸VP1_VP3和VP3两个区段基因序列设计的 2对特异性引物GRPl/GRP2和GFl/GF2 ,用该 2对引物对从鹅细小病毒野毒感染的病鹅分离的GPV野毒株进行PCR检测 ,结果 2对引物GRPl/GRP2和GFl/GR2 ,均能特异性地扩增出与预期片段大小相符的 0 .6bp和 1.6bp两个片段。回归试验的结果表明 ,该GFV野毒株的感染潜伏期为 8d ,病程为 1～ 3d ,致死率达 10 0 %。

摘要：目的建立一种猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)野毒株与基因缺失弱毒疫苗株TJM-F92一步RT-PCR鉴别方法。方法基于高致病性PRRSV TJ株及其基因缺失致弱疫苗株TJM-F92的nsp2基因序列设计1对引物,建立可鉴别不同高致病性PRRSV野毒株与基因双缺失弱毒疫苗株的一步法RT-PCR,并进行特异性、灵敏度、敏感性、重复性验证。结果高致病性PRRSV TJ株扩增出1 100 bp的条带,基因缺失弱毒疫苗株TJM-F92扩增出740 bp的条带,可对两毒株作出准确鉴别;建立的一步法RT-PCR可测出101TCID50/ml的PRRSV-TJ疫苗毒株,灵敏度较高;对已知阳性和阴性仔猪血清样品的检测结果100%相符,敏感性较高,且重复性较好。结论建立的一步法RT-PCR可用于接种TJM-F92疫苗猪群中PRRSV野毒感染与疫苗免疫猪的临床鉴别,有助于评价疫苗的免疫效果并及早发现野毒感染。

摘要：本研究旨在建立猪瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗株RT-PCR-RFLP鉴别检测方法。根据Shimen株设计1对特异性引物,建立猪瘟病毒RT-PCR-RFLP检测方法;对20份疑似猪瘟临床样品进行检测,并对检出的山东8株流行野毒株和2株疫苗株PCR产物进行克隆与序列分析,验证上述方法。结果RT-PCR扩增片段为825bp,产物经RFLP分析,野毒株的PCR产物能被ApaⅠ酶切为322bp和503bp 2个片段,兔化弱毒疫苗株则不能被酶切,检测出RNA的最低浓度为0.028 6μ***-1;8株流行野毒株都含GGGCCC序列(ApaⅠ酶切位点),2株疫苗株相应序列为GAGCCC,不能被ApaⅠ酶切;8株流行野毒株属于基因2群,2株疫苗株与HCLV遗传关系近,为基因1群。建立了可鉴别猪瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗株RT-PCR-RFLP检测方法,为猪瘟的防控提供有效手段。