摘要：根据锤头核酶模型，设计合成了一个以黄瓜花叶病毒（ＣＭＶ） 外壳蛋白（ＣＰ） 亚基因组ＲＮＡ 为底物的锤头型核酶（ＲＺＣ） 。在证明它能有效切割该底物后，再将这个核酶与一个能专一性切割烟草花叶病毒（ＴＭＶ） 移动蛋白（ ＭＰ） 亚基因组ＲＮＡ 的锤头型核酶（ＲＺ１） 相互串联构成了一个双价核酶（ＲＺ１Ｃ） 。体外结果表明，这个双价核酶能与相应的单价核酶ＲＺ１ 和ＲＺＣ 一样专一而有效地切割ＣＭＶＣＰ和ＴＭＶ ＭＰＲＮＡ。

摘要：针对丙型肝炎病毒ＲＮＡ（ＨＣＶＲＮＡ）的５′非编码区和部分Ｃ区的二级结构，设计并合成了四个不同的锤头型核酶（ｒｉｂｏｚｙｍｅＡ，ｒｉｂｏｚｙｍｅＢ，ｒｉｂｏｚｙｍｅＣ１，ｒｉｂｏｚｙｍｅＣ２）．首先应用体外切割实验筛选出作用于ＨＣＶＲＮＡ起始密码子上游ＧＴＡ↓位点的核酶ＲｚＡ有较好的活性．为初步验证核酶ＲｚＡ在细胞内的切割活性，经脂质体介导，将ＲｚＡＲＮＡ与另一携带该核酶靶基因的质粒表达载体ｐＣｌｎｅｏｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（载体中荧光素酶基因受核酶靶基因的调控）共转染ＨｅｐＧ２细胞．通过测定荧光素酶基因的表达证实了核酶在细胞内有较好的切割活性．在此实验基础上，把ＲｚＡ基因克隆至ｐＣｌｎｅｏ质粒表达载体中，再次经脂质体介导，将重组的表达载体ｐＣｌｎｅｏＲｚＡ与携带该核酶靶基因的质粒表达载体ｐＣｌｎｅｏｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ共转染ＨｅｐＧ２细胞，获得了更好的切割效果．

摘要：根据锤头型核酶的作用模式 ,设计、合成和克隆了特异切割苹果锈果类病毒ASSVd正链 (194- 196位点 )或负链 (89- 91位点 )RNA的 2个短臂锤头型核酶基因 :42nt的RzASSVd(+)和 40nt的RzASSVd(- )。经转录获得核酶转录物和3 2 P标记的ASSVd正、负链转录物。将核酶与ASSVd混合 ,5 0℃或 37℃保温 3～ 4h ,进行 8%PAGE(含8mol L尿素 )和放射自显影分析。体外切割检测表明 :2个核酶均具有特异切割活性 ,其中RzASSVd(- )对ASSVd负链的切割活性较高 ,对ASSVd正链不起作用。RzASSVd(+)对ASSVd正链的切割活性较弱 ,对ASSVd负链亦不起作用。在此基础上 ,构建得到双价核酶基因pGEMRzASSVd(± )。

摘要：为探讨锤头型核酶抗丙型肝炎病毒的作用 ,根据HCV 5′NCR及翻译起始区的二级结构 ,设计及合成了 1个锤头型核酶RzA .将其插入pCI neo表达载体的多克隆位点 ,构建了表达RzA的质粒pHCV RzA .采用转基因细胞模型HepG2 970 6细胞 ,评价了pHCV RzA质粒对HCV 5′NCR调控荧光素酶表达的抑制活性 .结果表明 ,在HepG2 970 6细胞中 ,pHCV RzA以序列特异性、剂量依赖性方式抑制荧光素酶基因的表达 ,抑制率达 80 % ,提示核酶有可能作为HCV感染基因治疗的一种有效途径 .

摘要：根据锤头型核酶的作用模式 ,设计、合成并克隆了特异切割马铃薯纺锤形块茎类病毒 (PSTVd)负链RNA不同区域位点的双价和三价锤头型核酶基因。通过体外转录 ,将PSTVd负链RNA分别与双价和三价核酶混合 ,37℃温育 2h。结果表明 ,双价核酶和三价核酶均表现出较高的切割活性 ,其中双价核酶处理的切割产物的大小与理论值相符合。三价核酶虽表现出较高的切割活性 ,但只是其中一价核酶在起作用。讨论了二价和三价核酶的应用前景。

摘要：锤头型适体酶目前已广泛用于基因表达调控,为了维持锤头型核酶高效自剪切的LoopⅠ和LoopⅡ之间的三级结构互作,现有的锤头型适体酶都是基于其stemⅢ或stemⅠ发展而来.为增加锤头型适体酶的多样性和通用性,探索基于stemⅡ的锤头型适体酶,通过理性设计基于stemⅡ的锤头型适体酶的链接体,基于毒蛋白基因ibsC报告体系,结合宿主的生长推测锤头型适体酶响应小分子调控的情况.设计了10种不同长度、不同碱基互补配对程度的链接体.其中7种链接体对应的锤头型适体酶无法发生自剪切;2种可以发生自剪切,但是不受茶碱调控;最终获得一个基于stemⅡ的锤头型适体酶T4,其链接体由4对完全互补配对碱基对组成,这表明由4对完全互补配对碱基对组成的链接体可能更容易获得小分子依赖的锤头型适体酶.在茶碱存在时,含有T4的宿主生长,而茶碱不存在时,其宿主不能生长,这表明锤头型适体酶T4的自剪切活性是受茶碱调控的,成功实现了利用小分子控制大肠杆菌中毒蛋白基因的表达.本研究表明T4是基于stemⅡ的依赖茶碱的锤头型适体酶,表明以锤头型核酶的stemⅡ也可以发展锤头型适体酶;此外,T4具有分子间剪切潜力,有望发展成为利用小分子调控内源性基因表达的工具.