摘要：目的　研究抗fas的锤头状核酶对小鼠细胞毒性T淋巴细胞 (CTL)系CTLL 2细胞fas基因的表达及其介导的细胞凋亡抑制作用 ,探索供者淋巴细胞输注 (DLI)时增强T细胞抗白血病的新途径。方法设计并合成抗fas的锤头状核酶基因 ,将其导入CTLL 2细胞 ,通过RT PCR、Westernblot和流式细胞仪分别检测核酶对CTLL 2细胞fasmRNA和Fas蛋白表达的抑制 ,以MTT法检测CTLL 2细胞与Fas抗体结合后的增殖活性 ,以半胱天冬酶 3(caspase 3)活性检测试剂盒检测细胞caspase 3蛋白酶活性 ,以流式细胞仪检测细胞凋亡 ,以乳酸脱氢酶法检测CTLL 2细胞的体外杀伤活性。结果锤头状核酶基因导入CTLL 2细胞后 ,可使其表面的Fas表达降低达 5 0 % ,细胞经Fas抗体 (JO2 )处理后 ,与空白对照、转染空载体的细胞相比 ,转染核酶的细胞增殖活性增加了 1倍 ,caspase 3活性降低近 5 0 % ,而细胞的凋亡率显著降低 ,只有 37% ,且CTLL 2细胞的体外杀伤活性为对照组的 2倍。结论该核酶具有切割fas基因的良好活性 ,并可抑制Fas介导的CTLL 2细胞凋亡 ,增加该细胞存活率 ,从而增强对Yac 1细胞的杀伤活性。

摘要：目的 探讨p53核酶对肝癌细胞突变型抑癌基因p53的抑制作用。方法 应用计算机设计并合成针对突变型p53(249位密码子AGG→AGT)的锤头状核酶RZ,构建其体外转录和真核表达载体,检测核酶对突变型p53(mtp53)的体外切割作用,并在Lipofect AMINE^(TM)2000的介导下转染肝癌细胞MHCC97,应用逆转录聚合酶联反应(RT—PCR)检测核酶对肝癌细胞突变型p53的抑制作用。结果 测序证实核酶基因被正确克隆入体外转录载体pBSKU6和真核载体pEGFPC1中。体外切割效率为42％,而野生型p53(wtp53)没有被切割。在LipofectAMINETM2000的介导下成功转染肝癌细胞MHCC97,RT—PCR检测证实突变型p53的mRNA水平明显下降,细胞内的切割效率为69％。结论 p53核酶可成功抑制肝癌细胞中突变型p53的表达,为肝癌的基因治疗提供了一个新的选择。

摘要：应用计算机对ｍｄｒ１ｍＲＮＡ二级结构进行模拟，设计针对ｍｄｒ１ｍＲＮＡ１９５９位ＧＵＣ的“锤头状（Ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ）”核酶（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ１，ＲＺ１）基因定点克隆于质粒ｐＧＥＭＥＸ１的ＢａｍＨⅠ和ＥｃｏＲⅠ位点上；将ｍｄｒ１ｃＤＮＡ１３８３ｂｐ的片段亚克隆于ｐＧＥＭＥＸ１的ＥｃｏＲⅠ位点上；在Ｔ３起动子作用下体外分别转录成ＲＺ１和１３８３ｎｔ的ｍｄｒ１ｍＲＮＡ，ＲＺ１在体外将１３８３ｎｔ的ｍｄｒ１ｍＲＮＡ切割成两个片段。

摘要：目的　研究锤头状核酶对雄激素受体 (AR)mRNA片段的体外切割活性 ,探讨抗雄激素基因治疗的新途径。方法　计算机模拟ARmRNA片段二级结构 ,选择第 10 18位GUC为核酶切割位点 ,设计特异性切割AR的锤头状核酶 (RZ) ,合成含T7启动子的核酶和底物模板链 ,体外转录RNA ,37℃条件下行核酶体外切割反应。结果　核酶在体外 37℃反应 1h ,可将 98%的底物RNA ( 2 5 5nt)切割为 16 8nt和 87nt2个片段。结论　特异性切割AR的锤头状核酶在体外对底物RNA有良好的切割活性 ,为应用核酶阻断雄激素受体基因表达奠定了基础。

摘要：目的　探讨抗主要组织相容性复合物(MHC)Ⅱ类分子转录激活因子的锤头状核酶对Raji细胞表面经典MHCⅡ类抗原表达的抑制作用。方法　设计并克隆针对MHCⅡ类分子转录激活因子(CⅡTA)第134、218、464位点的3 个核酶片段(Rz134、Rz218、Rz464)及其相应的CⅡTA靶基因,分别插入pGEM T载体,进行细胞外切割活性筛选。将切割作用明显的Rz464 亚克隆入真核表达载体pIRES2 EGFP,成为pIRES2 EGFP Rz464(pRz464),将pRz464稳定转染Raji细胞株,流式细胞术检测Raji细胞表面MHCⅡ类抗原(HLA DR、DP、DQ)的表达,并用逆转录聚合酶链反应分析Raji细胞CⅡTA mRNA的表达。结果　转染pRz464 的Raji细胞表面HLA DR、DP、DQ抗原表达抑制率分别为95.93 %、94.14 %及98.32 %,同时其CⅡTA mRNA的表达显著下调(P<0.05)。结论　Rz464可抑制Raji细胞表面MHCⅡ类抗原的表达。

摘要：目的构建蓝氏贾第鞭毛虫alpha-8贾第素(α-8 giardin)特异性锤头状核酶-GCV重组载体。方法采用RNA draw软件对蓝氏贾第鞭毛虫α-8贾第素基因序列(GenBank登录号为AY781323)的二级结构进行模拟分析,按照G∶C比例和锤头状核酶设计原则,选取合适的核酶切割靶点,设计特异性锤头状核酶(H8)序列,并将其与犬贾第虫病毒(GCV)连接,获得α-8贾第素特异性锤头状核酶-GCV重组载体(pGCV634/H8/1423)。将载体线性化体外转录产物电击转染至贾第虫滋养体细胞内。提取转染后24 h的各组虫体总RNA,并以其为模板采用RT-PCR验证转染效果及对靶mRNA的切割效果。结果成功设计、合成了蓝氏贾第鞭毛虫α-8贾第素mRNA锤头状核酶序列(H8),将其与犬贾第虫病毒载体(GCV)连接,成功构建了pGCV634/H8/1423;RT-PCR实验结果表明,重组载体pGCV634/H8/1423转染贾第虫细胞后24 h可检测到核酶RNA的存在,并实现了对α-8贾第素mRNA高效、特异的切割作用。结论构建的pGCV634/H8/1423能有效转染至贾第虫细胞内,并在其细胞内对α-8贾第素基因的mRNA具有高效、特异的切割作用。

摘要：目的　探讨核酶 (RZ)在细胞水平调节雄激素受体 (AR)基因表达的作用。方法　设计并合成针对AR的锤头状核酶序列 ,分子克隆技术构建活性核酶和无活性核酶表达载体 ,脂质体介导下转染雄激素受体表达阳性细胞株T47D。转染第 1～ 3天 ,应用免疫组织化学和逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)技术检测细胞内AR基因表达水平。结果　AR活性核酶表达载体转染后 ,T47D细胞ARmRNA水平降低 2 2 .4%～ 50 .7% (P 0 .0 5)。结论　成功构建AR锤头状核酶表达载体 ,能特异性切割ARmRNA 。

摘要：本文根据Ｈａｓｅｌｏｆｆ和Ｇｅｒｌａｃｈ发表的锤头状核酶结构，设计合成了针对ＨＢＶａｙｗ株Ｐ基因５＇－端２３６０位点（ＧＵＣ）的核酶ＲＣＰ，其作用底物为ＨＰＶａｙｗＰ基因的翻译起始区（２１４０－２４２２区段），运用基因克隆结合体外转录的方法，评价了ＲＣＰ的切割活性，结果表明，ＲＣＰ在体外成功地切割了长为３４０个核苷酸的靶ＲＮＡ分子，这一工作为我们进一步在细胞内评价ＲＣＰ抑制ＨＢＶ全基因组复制及其基因表达的研究创造了条件。

摘要：目的构建蓝氏贾第鞭毛虫丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)特异性锤头状核酶-犬贾第虫病毒(Giardia canis virus,GCV)重组载体。方法采用RNAdraw软件分析贾第虫编码丙酮酸激酶的基因序列,并设计特异性反义锤头状核酶(PKH)序列,将其与犬贾第虫病毒(GCV)连接,构建重组载体pGCV-PKH。将重组载体线性化体外转录产物,分别进行贾第虫细胞外、细胞内目的mRNA切割实验,采用荧光显微镜观察转染后24h的各组虫体。采用实时PCR对切割产物进行相对定量分析。结果构建了载有蓝氏贾第鞭毛虫丙酮酸激酶特异性锤头状核酶的犬贾第虫病毒重组载体pGCV-PKH。细胞内切割实验结果表明,荧光显微镜下只有pGCV-GFP转染组虫体显示绿色荧光,pGCV-PKH转染组丙酮酸激酶mRNA的相对含量约为正常对照组的33.14%。细胞外切割实验结果表明,该组载体能在细胞外有效切割丙酮酸激酶mRNA,在设定条件下,其切割效率为58.5%。结论重组载体pGCV-PKH能有效转染蓝氏贾第鞭毛虫细胞,并能在其细胞内外对丙酮酸激酶mRNA进行有效切割。

摘要：目的阿霉素是一种临床上广泛使用的抗肿瘤药物,但其治疗作用的发挥受到耐药性的限制。目前研究显示阿霉素主要通过诱导活性氧自由基的产生而杀死肿瘤细胞。人8-羟基鸟嘌呤-DNA糖苷酶(HOGG1)是一种DNA氧化损伤的修复酶,可特异性的切除由活性氧产生的8-羟基鸟嘌呤。针对这一机制,设计并合成HOGG1特异性的锤头状核酶基因,构建其真核表达载体并初步探讨在该基因作用下,人肺腺癌A549细胞株对阿霉素的药物敏感性的影响。方法人工设计并合成核酶基因(RZ),将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,阳性重组子由BamH和EcoR酶切,琼脂糖凝胶电泳鉴定及DNA测序证实。大量抽提阳性重组子并在非脂质体转染试剂FuGENE6的介导下引入A549细胞株,RT-PCR(逆转录多聚酶链反应)法鉴定转染,并半定量检测转染细胞中HOGG1mRNA表达的改变。MTT法检测细胞转染前后对阿霉素敏感性的变化;彗星试验检测细胞转染前后DNA氧化损伤修复能力的改变。结果经酶切电泳及DNA测序证实合成的核酶基因序列成功克隆入pcDNA3.1(+)中,命名为pcDNA3.1(+)-RZ。经RT-PCR法鉴定质粒成功导入靶细胞中,并检测到转染核酶的靶细胞中HOGG1mRNA表达下降36%,与空白细胞组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。MTT法检测显示转染细胞组对阿霉素的药物敏感性增加,与未转染细胞组之间差异具有统计学意义(P<0.05);彗星试验表明在1.0μg/mL阿霉素作用下,转染细胞组较未转染细胞组DNA损伤程度增加(P<0.05),但无时效关系。结论成功构建HOGG1特异性锤头状核酶真核表达载体。核酶在A549细胞内有效抑制靶基因HOGG1的表达,增加了该细胞对抗肿瘤药物阿霉素的敏感性。为进一步研究HOGG1基因的功能奠定了基础。