摘要：目的 建立RT-FQ-PCR检测新型隐球菌VAD1 mRNA的方法 ,探讨定量测定VAD1 mRNA用于CNM疗效评估的可行性.方法 依据GenBank收录的新型隐球菌VAD1 mRNA全序列,设计引物和TaqMan探针,建立RT-FQ-PCR检测VAD1 mRNA的方法 .检测25例CNM患者和30例其他神经系统疾病对照组患者脑脊液,评价方法 的敏感度及特异度;检测25例CNM患者急性期与恢复期脑脊液中VAD1 mRNA的表达量,分析VAD1 mRNA与CNM治疗效果的关系.结果 建立的标准曲线相关系数为-0.997 9,检测下限为101 拷贝数/μl,高、中、低浓度质粒标准品批内CV值分别为0.65%、0.89%和1.23%;RT-FQ-PCR法检测新型隐球菌的敏感度为96%（24/25）,特异度为100%（30/30）;急性期VAD1 mRNA表达量为3.042±0.906,明显高于恢复期的2.187±0.665,差异有统计学意义（t=4.583,P＜0.01）.结论 本研究建立的RT-FQ-PCR方法 具有较高的敏感度、特异度和重复性,适合于新型隐球菌的VAD1 mRNA检测;VAD1 mRNA表达水平与CNM的治疗效果有关.

摘要：目的建立荧光定量PCR(FQ-PCR)技术定量检测新型隐球菌(CN)的荚膜相关蛋白10(CAP10)基因mRNA,为新型隐球菌的诊断、预后及疗效判断提供依据。方法用逆转录PCR的方法从CN标准株(ATCC34874)中扩增得到CAP10,构建重组质粒标准品pGEMT-Easy-CAP10,以倍比稀释的标准品制备标准曲线。设计引物和探针,建立FQ-PCR反应体系并对其重复性、特异性和线性范围进行评价。结果成功构建了重组质粒标准品pGEMT-Easy-CAP10,并用倍比稀释的标准品制备了标准曲线Y=-3.11X+38.84。批内重复性试验CV值为0.31%,批间重复性试验CV值为2.73%。FQ-PCR体系能特异扩增新型隐球菌,特异性好,该体系的线性范围为101copies/μL～108copies/μL。结论成功建立CN的CAP10 mRNA的定量检测方法;该方法重复性好,特异性强。

摘要：目的探讨针对结构基因g6341的PCR-RFLP方法在新生隐球菌基因分型中的应用价值，并与PCR指纹分型法进行比较。方法以野生型噬菌体M13中针对小卫星DNA的核心序列为单引物，对受试的新生隐球菌进行PCR指纹分型。选择结构基因g6341进行PCR-RFLP分析，在序列保守区设计通用引物，筛选合适的限制性内切酶进行RFLP分析，并与PCR指纹法进行比较。g6341基因扩增片段测序，进行系统发育分析，研究各主要基因型间的亲缘关系。结果多位点基因序列分析表明，结构基因g6341可作为RFLP分析的合适靶点。对76株新生隐球菌的基因分型结果显示，针对g6341的PCR-RFLP方法与PCR指纹法结果一致。分析g6341基因部分序列得出，8种主要基因型菌株相互间的同源性在84％-97％之间，同一主要基因型菌株的同源性在99％-100％之间。分子发育树中，VNⅠ—VNⅣ基因型、VGⅠ—VGⅣ基因型分别聚在一类。结论针对结构基因g6341的PCR-RFLP方法可作为新生隐球菌分子分型的有效工具，对g6341基因的序列分析可揭示不同菌株间的遗传进化关系。