摘要：非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起家猪和野猪的一种高死亡率的传染性疾病。ASFV具有庞大的基因组,其中非结构蛋白pD1133L被预测为其编码的6个解旋酶之一。本实验室应用免疫沉淀-质谱联用(immunoprecipitation-mass spectrometry,IP-MASS)技术筛选与pD1133L互作的宿主细胞蛋白,发现细胞波形蛋白(vimentin,VIM)为pD1133L互作的宿主蛋白之一,但尚不清楚宿主蛋白VIM对ASFV复制的影响。【目的】探究ASFV与VIM的相互调控作用,揭示VIM促进ASFV复制的机制。【方法】通过免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)试验验证pD1133L与VIM存在互作关系;外源过表达VIM蛋白以及设计并合成VIM的si RNA探究VIM对ASFV复制的影响;利用Western blotting以及荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)方法检测ASFV对VIM蛋白水平以及转录水平的影响;通过Western blotting、间接免疫荧光试验(immunofluorescence assay,IFA)探究巨噬细胞感染ASFV后VIM磷酸化水平变化以及亚细胞定位变化情况;CCK-8试剂盒检测VIM磷酸化抑制剂KN-93处理的最佳浓度,并利用Western blotting以及IFA检测KN-93对VIM磷酸化、亚细胞定位以及对ASFV复制影响。【结果】VIM过表达促进ASFV复制,敲低VIM的表达则抑制ASFV复制;ASFV感染抑制VIM蛋白水平以及转录水平表达,且呈时间依赖性;ASFV感染后VIM发生磷酸化修饰且发生亚细胞定位改变,从而促进ASFV复制。【结论】证实了ASFV与宿主蛋白VIM之间的相互调控作用;初步确定ASFV感染后VIM受到ASFV pD1133L调控,亚细胞定位发生重排向核周聚集从而促进ASFV复制的机制。

摘要：旨在通过免疫信息学方法预测非洲猪瘟病毒(ASFV)结构蛋白的T、B细胞表位,为非洲猪瘟(ASF)表位疫苗的设计研制提供参考。从NCBI和RCSB数据库获取ASFV蛋白质序列和三维结构,利用IEDB、DTU Health Tech等数据库的生物信息学工具对ASFV的5种结构蛋白p72、p17、p49、M1249L和H240R的细胞毒性T细胞表位、线性B细胞和构象B细胞表位进行鉴定。结果显示:5种蛋白质均为亲水性,二级结构以无规则卷曲为主,仅M1249L例外;预测到抗原性良好、无毒、无致敏的细胞毒性T细胞优势表位27个,线性B细胞优势表位35个;预测到仅针对p72的构象B细胞优势表位2个。结论:ASFV的5种蛋白质可能具有多个潜在T、B细胞表位,其中B细胞表位相对占优,5种蛋白质中p72和M1249L最具疫苗研发前景,可结合蛋白质相关参数信息为构建ASF表位疫苗提供参考。

摘要：非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染猪所引起的一种急性、出血性、高度接触性传染病。自2018年ASF传入我国以来,已经流行了5年多,病毒已经演化出了低毒力的基因Ⅱ型和基因Ⅰ型弱毒株,以及基因Ⅱ型和Ⅰ型重组毒株,这为该病的防制和疫苗研发带来了巨大挑战。ASF减毒活疫苗(live attenuated vaccines,LAVs)能够诱导良好的免疫保护,具备商品化疫苗的潜力。鉴定和研究毒力相关基因(virulence-associated genes,VAGs)对于LAVs的研发至关重要,也是ASFV研究的热点和难点。因此,对已鉴定的ASFV VAGs进行全面系统的综述,总结VAGs编码蛋白的作用机制,同时展望如何全面鉴定ASFV VAGs及其编码蛋白的作用机制,以及如何利用已知的VAGs科学设计安全高效的LAVs,以期为ASFV的致病机制及LAVs研发提供参考。

摘要：建立一种特异、敏感、快速的实时荧光定量PCR(FQ-PCR)方法,用于非洲猪瘟病毒(ASFV)和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)的鉴别诊断。针对ASFV的B646L基因和HP-PRRSV的NSP2基因分别设计特异性引物/探针对,经优化反应体系、反应程序等反应条件,建立一种基于探针技术的FQ-PCR方法,验证方法的敏感性、特异性和重复性,对130份临床样品进行检测,并与OIE检测方法(ASFV)及国标方法(HP-PRRSV)进行比较分析。本研究成功建立的ASFV和HP-PRRSV二重FQ-PCR检测方法在10^(-1)~10^(5) copies/μL模板范围内有良好的线性关系;对ASFV和HP-PRRSV基因出现阳性扩增,但对猪日本乙型脑炎病毒(JEV)、猪瘟(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲经典株(VR2332株)、健康猪脾脏等7种病原核酸样品对照未出现扩增;批内、批间试验变异系数在0.53%~3.14%,重复性良好;对ASFV和HP-PRRSV的最低检测模板浓度均为10 copies/μL;利用建立的二重FQ-PCR方法对130份临床样品进行检测,检测结果与OIE检测方法(ASFV)及国标方法(HP-PRRSV)完全一致。本研究成功建立了鉴别ASFV和HPPRRSV二重FQ-PCR检测方法,为ASFV和HP-PRRSV的鉴别诊断提供了快速、敏感、特异且能满足临床检测需求的检测方法。

摘要：猪感染非洲猪瘟病毒后,发病率和病死率可高达100%,常造成巨大经济损失和社会影响。非洲猪瘟目前没有有效的预防性疫苗,主要防控手段为尽早发现传染源、切断传播途径。目前最常用的非洲猪瘟病毒检测方法是荧光定量PCR,但是该方法耗时长、实验条件要求高,不利于在基层单位使用。本研究通过对非洲猪瘟病毒基因进行分析,针对其中p72基因设计和合成了多条引物探针,通过实验确定最优引物探针浓度、反应退火温度、延伸时间等条件,再结合一体化核酸检测系统,最终建立了基于即时检测(Point-of-care test, POCT)技术的非洲猪瘟病毒核酸快速检测方法。该方法可以在50min内完成核酸提取、扩增和结果判读的检测全流程,并可以有效检出大于1000拷贝/mL的标本,为非洲猪瘟病毒防控提供了技术手段。

摘要：非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的一种高度传染性和致死性疫病,近年来给我国生猪产业的健康发展造成了沉重打击。ASFV庞大的基因组导致人们难以及时掌握流行毒株的全基因组序列。本研究旨在利用Nanopore三代测序技术建立一种简便可靠的ASFV全基因组测序方法。设计覆盖ASFV全基因组的31对引物并分为4个引物池对样本进行扩增,通过Nanopore测序技术对扩增产物进行测序,进一步优化相关生物信息学分析方法,最终成功建立了ASFV全基因组测序方法。应用该方法成功从某环境拭子样本中获取一株全长为189 416 bp的ASFV全基因组测序。经一代测序验证表明,在B646L、EP402R、E183L、MGF_360-12L、MGF_505-3R和I177L等关键基因及部分变异位点上,本方法结果与一代测序结果一致性100%;在全基因组水平上,本方法结果与二代测序结果一致性为99.94%。此外,在这项研究中,采用Nanopore测序技术发现了NP1450L基因与NP419L基因间区存在56 bp的重复序列插入(通过一代测序技术进行了验证),但是二代测序未能发现这一显著的变异特征。本研究成功建立了基于Nanopore技术的ASFV全基因组测序方法,该方法具有良好的简便性和可靠性,为当前ASF的防控和分子流行病学研究提供了一个重要手段。

摘要：非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的1种高致死性传染病。自ASF疫情暴发以来,ASF对全球养猪业造成巨大损失。ASFV是由许多蛋白质组成的复杂结构,这些蛋白的功能和作用机制研究尚不清楚,以及复杂的免疫逃逸机制,使得疫苗开发极具困难。为此,解析ASFV蛋白的结构和功能将有助于更清楚地了解病毒与宿主之间的相互作用,以及ASFV的复制和传播机制,有助于筛选保护性抗原,并设计更有针对性和更有效的ASF疫苗。本文总结了近年来ASFV蛋白结构功能和疫苗开发方面的研究进展和突破,以期为科学防控非洲猪瘟提供参考。

摘要：为建立一种鉴别诊断野生株和基因缺失株非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的方法,针对ASFV的B646L、EP402R、DP96R基因保守序列设计3套引物和探针,优化三重荧光定量PCR体系作为基础建立微滴式数字PCR(droplet digital PCR,dd PCR)检测方法,并对方法的特异性、灵敏性及重复性进行评估。结果显示,优化后的多重荧光定量PCR检测方法的标准曲线线性关系良好,对PRRSV、PEDV、PRV、VSV、PCV、RNase-free水、重组质粒标准品进行特异性检测,特异性良好;重复性试验结果显示,变异系数均小于2%;对3种重组质粒的最低检测下限均为102 copies/μL。参照上述多重荧光定量PCR方法优化后的条件,进行多重ddPCR检测方法的建立,并且对该方法进行评价。结果显示,ddPCR检测方法标准曲线的线性关系良好;特异性及重复性良好;最低检测下限B646L为11.6 copies/μL、EP402R为13.3 copies/μL、DP96R为16.9 copies/μL;ddPCR的检测灵敏度比荧光定量PCR有优势。使用建立的多重ddPCR方法对14份P3实验室中的样品进行实验室样品检测,样品检测符合率达到100%。成功建立了能够同时检测用于鉴别野毒株感染与疫苗株的荧光定量PCR和微滴式ddPCR方法。

摘要：为建立一种可以同时鉴别ASFV基因Ⅱ型强毒株、基因Ⅰ型弱毒株、I177L基因缺失疫苗毒株的TaqMan三重实时荧光定量PCR检测方法,设计了针对B646L、F778R和I177L基因的特异性引物和探针,并对该方法进行特异性、灵敏性和重复性试验检测,绘制标准曲线,最后用该方法和WOAH推荐的方法对临床样品进行检测和分型。结果显示,本方法特异性和灵敏性好,对B646L、F778R和I177L阳性质粒的最低检测下限分别为1、10和1 copies/μL,说明本方法敏感性高;且该方法在1×10^(0)copies/μL~1×10^(7)copies/μL模板范围内具有良好的线性关系;组内和组间变异系数均小于2%,重复性和稳定性良好。利用本方法和WOAH推荐的方法分别对临床样品进行检测,两种方法的ASFV阳性率和毒株分型结果一致。综上所述,本方法可以检测基因Ⅱ型强毒株、基因Ⅰ型弱毒株、I177L基因缺失疫苗毒株,为临床ASFV的检测和分型诊断提供了良好的技术支撑。

摘要：本研究利用叠氮溴化丙锭(PMA)与多重荧光定量PCR(qPCR)技术相结合,建立了一种可以实现非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染性与非感染性(活/死病毒)鉴别的检测方法。通过对ASFV p72、CD2v、MGF110-14L基因保守序列设计特异性引物及探针,建立p72、CD2v、MGF110-14L基因的多重qPCR检测方法。结果显示,本研究建立的多重qPCR检测方法具有较强特异性,与其他常见猪病毒性原无交叉反应;同时,该方法具有较高灵敏度,p72、CD2v、MGF110-14L基因的重组质粒标准品最低检出限均为102copies/μL。为弥补qPCR技术不能有效区分样品中活/死病毒的缺陷,本研究将构建的多重qPCR与PMA技术相结合。当加入PMA终浓度为10μg/mL、暗孵育10 min、光照强度40 W、光照15 min时,PMA能够抑制灭活病毒基因的扩增且对活病毒基因的扩增无影响;对比普通qPCR与多重PMA-qPCR的灵敏度可知,两者的灵敏度均为102copies/μL;将多重PMA-qPCR方法用于23份实际样品检测,结果显示,检测活病毒的准确率为100%,说明该方法能有效区分临床样品中具有感染性的ASFV。