摘要：根据公开发表的菜豆基因组和重测序数据,利用生物信息学的方法筛选出61950个高质量SNP位点,通过对目标位点进行探针设计评估,最终设计开发出分别包含40352、20855和10486个SNP位点的40K、20K和10K液相芯片。利用10K液相芯片,对89份菜豆品种进行靶向测序基因分型检测,结果显示菜豆的平均多态性信息含量值和基因多样性值分别为0.35和0.29。STRUCTURE和聚类分析将89份菜豆划分为2个品种群,该分类结果显示同一地域的菜豆品种遗传背景和果实性状大都较为相似。基于选择信号分析,共鉴定到103个处于强烈选择状态的区域,这些区域中的位点可为后续功能基因研究提供候选。

摘要：旨在利用二代靶向测序技术比较不同靶区对CRISPR/Cas9基因编辑结局的影响,为该技术应用过程中的靶区筛选提供技术参考。本研究进行如下试验:1)以小鼠Pyk2基因为研究对象,针对其第一外显子区设计3个靶区,通过打靶质粒构建、细胞转染及转染细胞DNA二代靶向测序等手段发现,不同靶区总体的基因编辑(Indels)效率相差较大(site1:32.0%;site2:7.9%;site3:69.5%),编辑修复的偏好性也存在较大区别;而对于同一靶区,总编辑效率在2组试验重复中较为稳定(site1:31.8%vs 32.3%;site2:7.4%vs 8.4%;site3:71.3%vs 67.8%),编辑的偏好性也相对一致;2)针对上述筛出的最佳靶区site1,通过sgRNA与Cas9体外转录、小鼠胚胎显微注射和移植及子代的基因型鉴定等手段,结果发现,上述靶区的基因编辑偏好性在基因编辑动物生产中也得到证实;3)利用上述得到的site1靶区插入一个碱基的突变小鼠,在原靶区位置设计与site1仅相差一个碱基的sgRNA。通过突变小鼠基因组PCR和Cas9酶体外切割试验发现,靶区切割位点单碱基的插入就对该靶区编辑的效率产生显著影响(49.2%vs 0%)。综上所述,靶区选择对CRISPR/Cas9基因编辑的结局影响显著,通过二代靶向测序可以有效筛选CRISPR-Cas9基因编辑靶区,并在模式动物生产过程中也获得较好的结果。此外,针对靶区切割位点的单个碱基插入对基因编辑效率影响显著。