摘要：为了克隆表达纯化鸡颗粒溶素（chicken granulysin,ChGNLY）并进行活力鉴定。本试验以基因组数据库预测的ChGNLY基因为模板设计引物,对提取的鸡脾脏总RNA进行RT-PCR,扩增得到的ChGNLY基因插入pMD-19T载体中并测序。将测序正确的GNLY基因克隆至pGEX-6p-1,构建重组表达质粒pGEX-6p-1-GNLY,并将其转化至感受态BL21,IPTG诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE、Western-blotting和蛋白质谱鉴定融合蛋白的正确性。CellTiter-Glo2.0Assay检测融合蛋白的生物学活性。另外,对GNLY的分子特性进行了生物信息分析。结果显示,测序结果显示克隆的ChGNLY片段长237bp,编码79个氨基酸,所表达的融合蛋白相对分子质量约为36 000。重组ChGNLY融合蛋白能特异性与人颗粒溶素抗体发生反应。纯化后的GNLY融合蛋白经CellTiter-Glo2.0Assay检测,发现其具有剂量依赖性的细胞毒活性。系统发生分析显示GNLY可明显分为4个群。结构分析发现,ChGNLY活性区域表面带有大量正电荷,且位点保守。结果表明,本试验利用原核表达系统成功表达了具有生物学活性的ChGNLY,为ChGNLY后续功能的研究奠定理论基础。

摘要：目的观察补肾方治疗肝肾阴虚兼湿热未尽型慢性乙型肝炎的免疫调控作用机制。方法收集HBV DNA阳性、ALT异常的肝肾阴虚兼湿热未尽型慢性乙型肝炎患者35例,其中治疗组22例给予补肾方治疗,对照组13例给予α-2b干扰素,疗程6个月,分别于用药前后检测患者谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆红素(TBIL)和HBV DNA水平,用流式细胞法检测外周血自然杀伤细胞(NK)的免疫效应分子穿孔素(PF)、颗粒酶B(GrB)、颗粒溶素(GNLY)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)的表达情况。结果两组治疗后ALT及AST均低于治疗前(P<0.05,P<0.01),治疗后组间比较差异无统计学意义。两组治疗后中医证候总积分都明显下降(P<0.01);治疗后治疗组总积分明显低于对照组(P<0.05)。治疗组治疗后的中医证候疗效总有效率明显高于对照组(P<0.05)。治疗组治疗后PF(%)34.86±31.60和GNLY(%)25.72±24.98均低于治疗前69.62±27.58,64.54±25.96(P<0.05),与对照组治疗后比较差异无统计学意义。结论补肾方治疗肝肾阴虚兼湿热未尽型慢性乙型肝炎的免疫调控作用机制在于降低NK细胞的相关免疫效应分子的表达,促进受损肝脏的痊愈。

摘要：目的研究慢性HBV感染者外周血自然杀伤细胞（NK细胞）免疫效应分子表达与感染状态的相关性。方法健康人作为对照组，慢性HBV感染者根据感染状态分为肝功正常高病毒复制组、肝功能正常低病毒复制组、肝功能异常高病毒复制组、肝功能异常低病毒复制组。应用流式细胞法检测外周血NK细胞的穿孔素（PF）、颗粒酶B（Gr B）、颗粒溶素（GNLY）、肿瘤坏死因子（TNF）α和干扰素（IFN）γ的表达，分析其与感染状态的相关性。组间比较用单因素方差分析；相关性分析采用直线相关Pearson分析。结果阳性细胞百分比同对照组（31．50％±27．64％）相比，肝功能正常高病毒复制组（59．74％±30．82％）和肝功能正常低病毒复制组（61．89％±33．30％）的GNLY表达增加有统计学意义；同对照组（57．38％±23．69％）相比，肝功正常高病毒复制组（39．89％±21．30％）、肝功能异常高病毒复制组（37．54％±18．79％）的IFNγ表达降低，P值均〈0．05，差异有统计学意义；肝功能正常高病毒复制组的PF、Gr B、GNLY（阳性细胞百分比分别为56．98％±38．34％、81．53％±19．58％、59．74％±30．82％）和肝功能正常低病毒复制组的PF、Gr B、GNLY（阳性细胞百分比分别为62．95％±31．98％、84．51％±14．57％、61．89％±33．30％）表达高于肝功能异常高病毒复制组（阳性细胞百分比分别为35．47％±29．64％，66．55％±22．92％，42．03±33．17％），P值均〈0．05，差异有统计学意义；除了TNFα和GNLY不具有相关性外，PF、Gr B、GNLY、TNF仅和IFNY之间呈两两正相关关系。结论高病毒复制水平的HBV感染者外周血NK细胞表达的IFNγ明显低于正常对照组；肝功能正常的HBV感染者外周血NK细胞表达的PF、Gr B、GNLY水平明显高于肝功能异常者。

摘要：目的:观察补肾方治疗肝肾阴虚兼湿热未尽型慢性乙型肝炎的免疫调控作用机制。方法:在曙光医院肝病门诊,收集HBV DNA阳性、ALT异常的肝肾阴虚型慢性乙型肝炎患者35例,随机分为治疗组和对照组,治疗组给予补肾方治疗,对照组给予α-2b干扰素治疗,疗程均为6个月,分别在用药前后用流式细胞法检测患者外周血T细胞的免疫效应分子穿孔素(perforin,PF)、颗粒酶B(granzyme B,GrB)、颗粒溶素(granulysin,GNLY)、TNF-α、IFN-γ的表达情况。结果:治疗组CD4+T细胞表达的GNLY、IFN-γ及CD8+T细胞表达的GrB、IFN-γ、TNF-α均明显降低。结论:补肾方通过减少T细胞免疫效应分子的表达,防止肝脏进一步受损,发挥治疗肝肾阴虚兼湿热未尽型慢性乙型肝炎的作用。