摘要：背景:骨形态发生蛋白质是目前发现惟一的一类具有成骨能力的细胞因子,它能刺激基质干细胞向成软骨细胞和成骨细胞方向分化。目的:应用基因工程方法,观察人骨形态发生蛋白质7基因转染兔骨髓基质干细胞向成骨细胞的定向分化。设计:单一样本观察。单位:中山大学附属第一医院骨科。材料:pcDNA1.1/AMP-hBMP7质粒。方法:实验于2004-05/2005-03在中山大学附属第一医院外科实验室完成。全骨髓培养法培养兔骨髓基质干细胞,在体外分别转染pcD-NA1.1/AMP-hBMP7和pcDNA1.1/AMP并留置空白对照。检测转染基因的转录和表达,观察细胞形态和生长情况,通过对感染细胞的碱性磷酸酶染色、钙盐染色、电镜观察胞质中钙质成分以及检测骨钙素鉴定其成骨分化表型。主要观察指标:①兔骨髓基质干细胞的形态及生长。②表达产物的鉴定。③碱性磷酸酶染色(钙钴法)结果。④茜素红染色结果。⑤透射电镜观察结果。⑥扫描电镜观察结果。⑦骨钙素的测定结果。结果:人骨形态发生蛋白质7基因存在于转染后的骨髓基质干细胞中并表达相应的mRNA。目的基因表达后的细胞形态略有变化,但生长曲线与未转染组无明显变化。骨钙素表达较未转染组明显增强。转染组细胞的碱性磷酸酶染色和钙盐染色均为阳性。结论:人骨形态发生蛋白质7基因转染可促进兔骨髓基质干细胞向成骨细胞表型分化。

摘要：目的研究海螵蛸一骨肜态发生蟹白（BMP）复合材料对骨缺损大鼠成骨及再血管化的影响、方法将海螺蛸去外壳，制成圆柱体（直径约5mm，高约2toni），浸泡于重组入骨形态发生蛋白2溶液flI制作海螵蛸-BMP复合材料。将30只SD大鼠制成颅骨缺损模剂，按照随机数字表法分成海螵蛸一BMP纰与单纯海螵蛸组，每组15只，分别植入相应材料修复颅骨缺损。移植术后4、6、8蚓，2组各取5只大鼠．分批放血处死同时行墨汁灌注。ld后取出全部植入物和周围部分颅骨同时进行植入区大体观察，制作切片行Hf￡及Masson染色，通过组织病理学技术、图像采集系统，观察、分析做血锊面积卡¨新生骨面积。对数据行两因素析因设计方差分析和LSD检验，并对海螵蛸一BMP组入鼠做I血管面积和新生骨面积的相关性行Pearson相关分析。结果（1）植入区大体观察可见植入物被纤维结缔组织包膜包裹，移植术后4周包膜质地柔软、较厚；移植术后6、8周包膜质韧、薄，但较致密。植人物移植术后4同时转为胶冻样物质，移植术后6、8同时与软骨组织类似。（2）组织学观察显示．移植术后4周，2组大鼠植入物结构均遭到破坏，并可见中等数量的炎性细胞浸润；海螵蛸一BMP组初级骨小梁、微血管数量明显多于单纯海螵蛸组，破骨细胞数鼠则少于单纯海螵蛸组。移植术后6周，2组大鼠植入物炎性细胞明显减少，海螵蛸进一步降解，新生微血管更加丰富，植人物周边均彤成明显的成熟骨小梁，但海螵蛸一BMP组在降解后的海螵蛸一BMP中也出现了成熟骨小梁。移植术后8周，2组大鼠植入物炎症反应消失，成熟’目r，J、梁显著增多，海螵蛸的网格状结构基本被破坏，单纯海螵蛸组的成熟骨小梁仍分布在海螵蛸周边；而海螺蛸一BMP组中，海螵蛸．BMP中央、周围均可成熟骨小梁，徽血管数量仍多于单纯海螵蛸组。（3）移植术后4～8周，海螵蛸一BMP组微血管面积[（63±4）、（136±36）、（347±3】）μm^2]大于单纯海螵蛸组[（44±7）、（73±4）、（268±42）un1。，P〈0．05或P〈0．01]；新，￡骨甬i积[（236±26）、（339±42）、（553±40）斗m!]人于嗨纯海螵蛸组[（137±15）、（243±21）、（445±29）仙m。，P值均小于0．0I]．．（4）海螵蛸-BMP纰做血管面积与新生骨积‘士娃菩止州关（r=0．948，P：0．001）．．结论海蝶蛸．1{MP复合材料对骨缺于fIj大鼠具有较好的成骨及阿血管化作¨j，是骨组织1科优良的三维支架和找体材料。

摘要：背景:血管内皮生长因子和骨形态发生蛋白具有协同促进血管生成的作用。目的:构建在真核细胞中表达人血管内皮生长因子165的红色荧光蛋白表达载体和携带人骨形态发生蛋白2的绿色荧光蛋白表达载体,共转染真核细胞以研究血管内皮生长因子165和骨形态发生蛋白2在293-T细胞内的表达和定位。设计:随机对照实验。单位:解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所国家重点实验室。材料:实验于2002-09/2004-03在解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所国家重点实验室完成。pCDNA3.1(+)/骨形态发生蛋白2由美国UCLA大学***惠赠;pDsRed1-N1由***,UniversityofCalifornia,SanDiego,USA惠赠。pUC18/血管内皮细胞生长因子165,293-Tcells由本实验室保存。方法:根据已知的人血管内皮生长因子165序列,设计在目的片段两端分别携带酶切位点的两条引物,用聚合酶链反应从质粒pUC18/血管内皮生长因子165中扩增出去除终止密码子的人血管内皮生长因子165片段,定向克隆至含报告基因的质粒pDsRed1-N1中,构建重组质粒pDsVEGF165Red1-N1;同时,构建pIRES2-骨形态发生蛋白2-加强型绿色荧光蛋白表达载体。以DOTAP为介导,将重组质粒共转染293-T细胞,48h后用激光共聚焦显微镜检测报告基因红色荧光蛋白和加强型绿色荧光蛋白的表达,使用反转录聚合酶链反应及免疫印迹方法检测血管内皮生长因子165和骨形态发生蛋白2在细胞内表达。主要观察指标:质粒的酶切鉴定及重组质粒在293-T细胞中mRNA及蛋白水平的表达。结果:重组质粒经酶切、聚合酶链反应和DNA序列测定证明构建正确,目的基因在293-T细胞中在mRNA及蛋白水平获得表达。激光共聚焦显微镜观察到红色荧光蛋白和加强型绿色荧光蛋白在细胞内共定位的情况。结论:成功构建pDsVEGF165Red1-N1和pIRES2-骨形态发生蛋白2-加强型绿色荧光蛋白2种含报告基因的真核表达载体,两者共转染后能在真核细胞中表达,为研究血管内皮生长因子165和骨形态发生蛋白2在细胞内的相互作用提供了一个重要而方便的工具。

摘要：目的:骨形态发生蛋白2是目前研究最为广泛、诱导成骨活性最强的骨形态发生蛋白之一。实验拟构建绿色荧光蛋白标记的人骨形态发生蛋白2(human Bone Morphogenetic Protein-2,hBMP2)真核表达载体,为在真核细胞的高效表达和基因治疗打下基础。方法:实验于2006-03/2007-03在天津医科大学卫生部激素与发育重点实验室完成。①实验材料:含完整人骨形态发生蛋白2基因片段的pcDNA3.1/CT-hBMP2质粒由李曦铭博士惠赠;双顺反子真核表达载体pSELECT-GFPzeo-MCS(Invivogen公司),Zeo(Invivogen公司);pTA2?-T Easy(鼎国生物技术有限公司)。②实验过程及评估:以重组质粒pcDNA3.1/CT-hBMP2为模板,结合已设计好的特异性引物,采用聚合酶链反应方法亚克隆出人骨形态发生蛋白2目的片段,将该片段分别与克隆载体pTA2-T-easy和双顺反子真核表达载体pSELECT-GFPzeo-MCS连接,转化入感受态DH5α细胞中,通过筛选得到含有绿色荧光蛋白的重组表达载体pSELECT-GFPzeo-hBMP2,并进行测序鉴定。结果:①聚合酶链反应获得长度约1216bp的目的片段,与预期片段相符。②经与克隆载体pTA2-T-easy和真核表达载体pSELECT-GFPzeo-MCS连接,筛选及序列分析后,证实所插入目的片段与GenBank检索的骨形态发生蛋白2cDNA序列(NM-001200)100%匹配。结论:成功构建含双顺反子绿色荧光蛋白人骨形态发生蛋白2真核表达载体。

摘要：目的:骨形态发生蛋白信号在神经细胞的生长、分化、增殖、凋亡等方面发挥作用,而Sonic hedgehog能调节小脑颗粒细胞的增殖,故实验设计了去除骨形态发生蛋白信号后Sonic hedgehog信号在小脑颗粒细胞发育中作用的观察。方法:实验于2004-11/2005-10在美国费城儿童医院Crenshaw实验室和北京大学医学部解剖学神经研究实验室完成。①实验材料:C57Bl/6J小鼠40只;Bmpr1b敲除鼠系来源于Karen Lyons博士。②实验过程:通过敲除骨形态发生蛋白Ⅰ型受体的Bmpr1a和Bmpr1b两个亚型基因,去除骨形态发生蛋白信号在小脑内的传导。③实验评估:使用原位杂交和免疫组织化学方法检测了新生幼鼠小脑中Sonic hedgehog信号的表达情况。结果:①在胚胎11.5d,磷酸化SMAD免疫阳性的细胞被观察到在正常鼠神经管背侧的菱形唇附近,受体基因双敲除的小鼠背侧神经管中未发现免疫阳性细胞,此结果提示通过骨形态发生蛋白Ⅰ型受体传导的骨形态发生蛋白信号已消失。当小鼠出生后,磷酸化SMAD免疫阳性细胞主要位于正常小鼠的内颗粒层,在基因敲除鼠只有一小部分区域有磷酸化SMAD蛋白的表达。②Sonic hedgehog表达在正常新生鼠小脑的颗粒细胞层和蒲肯野氏细胞层;基因敲除鼠Sonic hedgehog信号只表达在小脑一小部分区域的颗粒细胞层和蒲肯野氏细胞层,而大部分区域则缺少它的表达。PTCH和N-myc在小脑中的表达与Sonic hedgehog表达部位类似。这提示Sonic hedgehog信号及其PTCH和N-myc都参与了小脑颗粒细胞的发育。结论:实验阐明了骨形态发生蛋白信号去除后,Sonic hedgehog信号对小脑颗粒细胞发育所起到的重要作用。

摘要：背景:有学者认为手术增加了颈椎不稳定的风险,后纵韧带的张力有可能改变体内生长因子表达。然而两者是否存在关系还没有定论。骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)4是具有独立异位成骨作用的细胞因子之一。目的:观察颈椎后路减压对颈椎后纵韧带中骨形态发生蛋白4mRNA表达的影响。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2005-01/2006-12在泰山医学院完成。材料:清洁级成年SD大鼠48只,雌雄不拘,体质量270～350g。方法:将大鼠随机分为3组。手术组:行C3～6全椎板切除减压加椎旁肌切断手术;假手术组:仅作皮肤切口;空白组:不作任何处理为。于处理后1,2,4,8周分批处死动物,取其后纵韧带。主要观察指标:采用半定量反转录-聚合酶链反应方法检测组织骨形态发生蛋白4 mRNA表达水平。结果:空白组及假手术组未见明显骨形态发生蛋白4 mRNA的表达;手术组于手术后1周表达明显,持续到8周。结论:颈椎后路减压手术可以导致后纵韧带早期细胞骨形态发生蛋白4 mRNA表达上升,内源性的骨形态发生蛋白4可能导致手术后韧带骨化发展。

摘要：背景:鸡冠花黄酮类化合物是一种植物性雌激素,具有多种生理功能,且无毒副作用,对骨质疏松的治疗和预防都具有良好干预效果。目的:探讨鸡冠花黄酮化合物对糖尿病大鼠骨形成蛋白、尿无机盐以及溶菌酶含量的影响。设计:随机区组分组设计,设立对照实验。单位:新乡医学院药物研究室。材料:实验于2003-09/12在新乡医学院完成。选用健康雌性SD大鼠24只。按区组随机法分组法将大鼠分为3组:正常对照组,糖尿病模型组,糖尿病+鸡冠花黄酮组,每组8只。方法:①糖尿病+鸡冠花黄酮组和糖尿病模型组大鼠腹腔注射链脲佐菌素60mg/kg,48～72h后尾静脉采血,测定全血血糖,血糖≥16.7mmol/L确定为糖尿病大鼠,血糖未达16.7mmol/L者立即腹腔补注链脲佐菌素60mg/kg。造模后糖尿病+鸡冠花黄酮组给予鸡冠花黄酮100mg/(kg·d)灌胃,正常对照组仅注射等量生理盐水。②各组干预10周后,采用原子吸光光度法测定大鼠尿钙含量,火焰分光光度法测尿钠、钾含量。③采用过氧化物酶标记的链霉卵白素法按照说明书进行骨形成蛋白2免疫组织化学测定,用HPIAS-2000图像分析仪对各组骨形成蛋白2免疫组织化学表达进行定量分析。④采用微量溶菌酶比色法测定反映肾小管的重吸收功能的溶菌酶含量。⑤组间差异比较用t检验。主要观察指标:各组干预10周后,大鼠尿钙、钠、钾及溶菌酶含量及骨形成蛋白2免疫组织化学表达比较。结果:SD大鼠24只均进入结果分析。①糖尿病模型组大鼠的尿钙、钠含量明显高于正常对照组,尿钾显著低于正常对照组(P0.05)。②糖尿病+鸡冠花黄酮组和正常对照组大鼠骨组织骨形成蛋白2表达明显高于糖尿病模型组,尿溶菌酶含量明显低于糖尿病模型组(P<0.05～0.01)。结论:糖尿病大鼠骨组织骨形成蛋白2表达明显下降,补充鸡冠花黄酮类化合物后动物骨骨形成蛋白2表达升高,糖尿病大鼠的尿钙和尿钠的排出显著降低,肾小管的重吸收功能提高。

摘要：背景:股骨头血供中断或受损引起骨细胞及骨髓成分死亡引发股骨头坏死。多种成骨相关因子如Runt相关转录因子2(Runx2)、骨形态发生蛋白、骨保护素、骨钙素,在其随后修复过程中发挥重要作用。研究发现Runx2基因为成骨分化和骨形成过程中的控制基因,能促进前成骨细胞中各种矿化相关蛋白基因的转录,使其向成骨细胞方向分化,从而在骨修复中起到关键性的作用。方法/设计:研究在中国医科大学附属盛京医院完成,为回顾性、单中心、非随机平行对照试验。研究纳入拟进行全髋关节置换的15例股骨头坏死患者和15例骨关节炎患者。试验在术中获得的骨组织标本,以股骨头颈组织Runx2 m RNA表达为主要观察指标,以骨形态发生蛋白2、骨形态发生蛋白7、骨保护素m RNA表达,以及骨钙素免疫反应为次要观察指标。试验方案已在Clinical ***注册(注册号NCT02735538),试验方案取得中国医科大学附属盛京医院伦理委员会的书面批准(批准号:2016PS222K),并取得受试者或监护人的书面知情同意。讨论:股骨头坏死患者股骨头颈组织包括Runx2 m RNA在内的多个骨修复相关基因表达的检测已于2010至2011年完成。研究结果为阐释Runx2 m RNA在股骨头坏死中可能扮演的角色,以及对骨修复重建的意义有所贡献。

摘要：背景:仿生结构是近年来组织工程支架设计最重要的目标之一,但文献报道的仿生支架多不具有缓释生长因子的能力。目的:制备新型仿生纳米纤维肝素/明胶复合支架,观察其微观结构、机械强度及对重组人骨形态发生蛋白2的缓释作用。方法:利用化学交联方法制备肝素化明胶材料,将不同比例的普通明胶和肝素化明胶材料混合,利用热致相分离法和模板成孔技术,制备出含0,20%,40%肝素化明胶的纳米纤维肝素/明胶复合支架。扫描电镜观察新型支架的微观结构,甲苯胺蓝法检测各组支架中的肝素含量,测试支架机械强度,采用ELISA法测定各组支架对重组人骨形态发生蛋白2的释放情况。结果与结论:①纳米纤维肝素/明胶复合支架有很高的孔隙率,大孔结构250-420μm,孔隙连通度良好,且孔壁具有仿生纳米纤维结构;②含0,20%,40%肝素化明胶的纳米纤维肝素/明胶复合支架中的肝素含量分别为0,(12.82±2.49),(25.08±3.69)mg/g,3组间比较差异有显著性意义(P0.05);④随着肝素化明胶含量的增加,纳米纤维肝素/明胶复合支架对重组人骨形态发生蛋白2的吸附能力增强,显著降低重组人骨形态发生蛋白2的突释,延长释放时间。

摘要：背景:骨髓间质干细胞在地塞米松等骨诱导剂的作用下能够向成骨细胞分化;同时骨形成蛋白2在骨修复过程中促进细胞增殖分化和基质分泌,在体内外均可诱导骨形成,以上二者联合应用可能会产生一定的协同效应。目的:分析体外经地塞米松诱导是否能增强骨形成蛋白2基因修饰的骨髓间质干细胞的成骨转化能力。设计:随机化配对设计。单位:解放军第四军医大学西京医院。材料:实验于2004-02/2004-08在解放军第四军医大学全军骨肿瘤研究所完成。选用2月龄新西兰白兔20只,由解放军第四军医大学实验动物中心提供(许可证号:军动管字第2005C00117号)。室温、常湿,正常喂食。双侧取材,左侧肢体来源骨髓间质干细胞为地塞米松诱导组,右侧为对照组(未经诱导)。方法:将地塞米松诱导组和对照组兔骨髓间质干细胞分别转导含有人骨形成蛋白2基因的复制缺陷重组腺病毒Ad-BMP-2后,以反转录-聚合酶链反应和免疫组化方法检测细胞中骨形成蛋白2的表达情况。观察骨髓间质干细胞的生长情况,并应用碱性磷酸酶检测试剂盒及骨钙素放免试剂盒测定Ad-BMP-2转导5d后两组骨髓间质干细胞的碱性磷酸酶活性和骨钙素含量。主要观察指标:①骨髓间质干细胞中骨形成蛋白2的表达情况。②骨髓间质干细胞的形态学变化。③骨髓间质干细胞中碱性磷酸酶活性和骨钙素含量。结果:①转导后骨形成蛋白2基因在地塞米松诱导组和对照组兔骨髓间质干细胞中均有表达。②骨髓间质干细胞经地塞米松成骨诱导后形态较不规则,呈三角形、多角形改变,较基础培养基培养细胞生长缓慢。基因转导后细胞形态无明显改变。③转基因5d后,地塞米松诱导组骨髓间质干细胞培养上清中碱性磷酸酶活性高于对照组[(134.36±8.84,104.02±7.83)nkat/L(t=3.3506,P<0.01,n=20)];地塞米松诱导组骨髓间质干细胞骨钙素分泌量高于对照组[(14.68±0.73,6.52±1.21)μg/L(t=3.5682,P<0.01,n=20)]。结论:转基因前的地塞米松诱导能够促进骨形成蛋白2基因修饰的骨髓间质干细胞增殖和成骨转化。