摘要：背景:临床修复喉甲状软骨缺损时使用一定的支架材料。骨形态发生蛋白具有成骨诱导活性,与其他形式的载体联合起来进行复合应用可以更好的发挥出其诱导成骨作用。联合使用计算机辅助设计/计算机辅助制造技术能提高修复效果。目的:进一步验证骨形态发生蛋白复合物结合计算机辅助设计/计算机辅助制造技术在原位修复喉甲状软骨缺损中的应用效果。方法:纳入18只新西兰大白兔,对动物喉部进行三维扫描,建立兔甲状软骨三维数字模型。利用泡沫凝胶注模法制备羟基磷灰石支架,再制备骨形态发生蛋白复合物。18只动物随机分为观察组和对照组。两组兔行一侧甲状软骨切除后,观察组植入珊瑚羟基磷灰石支架;对照组填充明胶海绵。处理后4,8,12周,进行大体观察和评分;处理后12周,对动物行喉镜检查,喉组织常规切片后进行苏木精-伊红染色,进行组织学观察。结果与结论:处理后12周,对照组兔的喉腔出现明显的变窄现象,且存在轻微充血;观察组喉腔黏膜光滑,且通畅、宽敞,未出现肉芽生长情况。处理后4,8,12周,两组喉甲状软骨评分均呈现出不断下降的情况,且不同时间点,观察组评分均显著低于对照组(均P<0.05)。处理后12周,对照组未出现成熟骨细胞和软骨细胞的生成;观察组则可见植入材料完全降解,存在大量多核样组织细胞增生和吞噬,手术区域软骨母细胞出现增生现象,并伴有成软骨区域形成情况,另外还以观察到软骨骨质形成以及软骨细胞增生现象。结果表明,利用骨形态发生蛋白复合物结合计算机辅助设计/计算机辅助制造技术进行原位喉甲状软骨缺损修复可以获得良好的效果,实验过程中所使用的复合物具有良好的骨诱导作用以及组织相容性。

摘要：背景:在卵巢去势后雌激素缺乏状态下,由于骨质疏松时全身及局部骨结构发生骨量减少和骨微细结构以及生长因子基因定位分布变化,无疑会对骨折愈合产生明显的影响。目的:观察雌激素对骨折愈合过程超微结构变化和骨生长因子骨形态发生蛋白4基因表达及定位分布的影响。设计:随机对照观察。单位:云南大学分子生物学实验室。对象:实验于1999-07/2002-07在云南大学分子生物学实验室完成。选用健康2月龄雌性SD大鼠96只,平均质量160～200g。方法:①取96只大鼠腹腔麻醉后,其中48只作双侧卵巢切除术为骨质疏松组,余48只行假手术为对照组。所有大鼠1个月后,在麻醉状态下于双侧胫骨骨干中段行手法折断,任其自行修复,制作成骨折愈合模型。两组动物分别于骨折后1,3,5,7,14,28,56,112d麻醉后处死取骨痂和周围软组织,每个时间点取6只。②大鼠胫骨骨组织超微结构采用电镜下观察。③骨痂组织和软组织骨形态发生蛋白4表达采用原位杂交法观察,杂交液中不加标记探针作为阴性对照。选取两组1,3d时间点原位杂交阳性表达切片各6张,每张在25倍物镜下随机选取3个视野,统计每个视野所有阳性表达颗粒数。主要观察指标:①两组大鼠胫骨骨组织超微结构观察结果。②骨痂和软组织骨形态发生蛋白4表达结果。结果:96只大鼠均进入结果分析。①两组大鼠胫骨骨组织超微结构观察结果:骨折28d以后,对照组骨性骨痂、骨胶原纤维性排列致密,骨陷窝中见骨细胞,体积小、胞质少,但体积小骨小梁周围见破骨细胞。骨质疏松组:纤维性骨痂、骨基质中胶原纤维排列疏松,成骨细胞数量多、体积大,破骨细胞多见。②骨痂和软组织骨形态发生蛋白4表达结果:骨折后1～3d,对照组<骨质疏松组(23.7143±5.0568,21.7143±5.0238比51.2857±8.1387,49.5714±9.0711,P<0.01)。表达局限于骨折周围骨痂形成区的软组织内。结论:卵巢切除后骨质疏松组大鼠骨形态发生蛋白4基因表达增多,并呈现一定的区域性,即局限于骨折周围的软组织内。骨折愈合过程中骨痂基质的形成和质量明显低于对照组。

摘要：背景:骨形态发生蛋白有较强的诱导成骨作用,寻找一个合适的载体成为目前研究的热点问题。磷酸钙骨水泥因为具有许多优点而可能成为其良好的载体。目的:评价磷酸钙骨水泥/骨形态发生蛋白复合物及单纯磷酸钙骨水泥对实验性股骨头缺血性坏死的修复作用。设计:随机对照的实验。单位:解放军第二○八医院动物实验室。材料:健康成年兔24只,体质量2.5～3.0kg,雌雄不限。骨形态发生蛋白(由第四军医大学西京医院骨科研究所提供)。磷酸钙骨水泥(由吉林大学第一医院骨科同日本爱知医科大学整形外科及日本三菱公司材料综合研究所共同研究开发)。方法:实验于2003-04/2004-04在解放军第二○八医院动物实验室完成。将磷酸钙骨水泥复合骨形态发生蛋白制备成磷酸钙骨水泥/骨形态发生蛋白复合材料。兔24只,随机分为2组,即磷酸钙骨水泥/骨形态发生蛋白复合物充填组及单纯磷酸钙骨水泥充填组,每组12只。制作实验性股骨头缺血性坏死骨缺损模型后于骨髓道内充填磷酸钙骨水泥或磷酸钙骨水泥/骨形态发生蛋白复合物,术后动物3周及12周时分批处死动物进行X射线、组织学及电镜观察。主要观察指标:各组兔的成骨情况,骨缺损的修复情况及材料降解情况。结果:24只兔进入结果分析。①两组兔骨缺损区大体观察和X射线检查结果:术后12周时,磷酸钙骨水泥组可见有许多新骨形成,材料体积变小。磷酸钙骨水泥/骨形态发生蛋白组有大量新骨形成,降解吸收现象明显,材料体积明显变小。②两组兔股骨头标本组织形态和超微结构观察结果:12周时磷酸钙骨水泥量减少,与新生骨之间部分区域可见空隙存在,新生骨小梁增粗,可见幼稚骨细胞,其细胞核圆形,染色质有轻度超边,粗面内质网扩张,线粒体有空化及嵴断裂现象;磷酸钙骨水泥/骨形态发生蛋白组可见散在磷酸钙骨水泥,新生骨长入材料并与之相互分割包裹,成骨细胞紧帖附于磷酸钙骨水泥颗粒,其胞浆内粗面内质网增多扩张,线粒体增多肿胀,大量毛细血管侵入材料内部,血管周围依附较多成骨细胞。结论:磷酸钙骨水泥是骨形态发生蛋白的理想载体,磷酸钙骨水泥/骨形态发生蛋白复合材料传导成骨和诱导成骨活性大于单纯磷酸钙骨水泥组,对实验性股骨头缺血性坏死具有修复作用。

摘要：背景:羟基磷灰石可以作为一种良好的支架材料,重组人骨形态发生蛋白2是目前活性较强的成骨因子,设计一种复合的新型材料有助于解决骨缺损修复问题。目的:探索中空羟基磷灰石微球复合重组人骨形态发生蛋白2对兔骨缺损成骨行为和生物力学的影响。方法:将48只雄性健康成年新西兰白兔随机分3组(n=16),制备桡骨缺损后,复合人工骨组将已经制备好的中空羟基磷灰石/重组人骨形态发生蛋白2复合人工骨植入缺损处,单纯人工骨组植入单纯中空羟基磷灰石人工骨,对照组不植入任何材料。于术后第4,8,12,16周第1天检测血清碱性磷酸酶水平,通过X射线摄片、CT三维重建、放射性核素骨显像及生物力学等评估愈合效果。结果与结论:1复合人工骨组术后各时间段的血清碱性磷酸酶活性、X射线评分、成骨效果、放射性核素聚集强度、CT三维重建及生物力学强度均优于单纯中空羟基磷灰石人工骨,而对照组显示骨缺损愈合不良;2结果表明,中空羟基磷灰石/重组人骨形态发生蛋白2复合人工骨具有更强的成骨能力和力学强度,加速了骨缺损愈合进程。

摘要：背景:牙齿缺失后,牙槽骨内成骨与破骨的动态平衡被打破,牙槽嵴呈现出不可逆转的骨吸收,其后果是大量的牙槽骨丢失;骨形态发生蛋白在骨及牙齿的生长发育和创伤修复中发挥重要作用。目的:观察原核表达的重组人骨形态发生蛋白7对增强牙槽嵴的新骨形成、预防牙槽嵴吸收的作用。设计:对照实验。单位:济南市口腔医院正畸科,山东省医学科学院。材料:实验于2003-06/2004-12在山东省医学科学院完成,采用新西兰大白兔28只,雌雄不限,体质量平均2kg。方法:采用大白兔建立动物拔牙创模型,将大白兔分别拔除左、右下门牙,将骨形态发生蛋白7复合载体2块40μg植入右下门牙(为实验组),仅含磷酸盐缓冲液的空载体2块40μg植入左下门牙(为对照组),术后2,4,8及12周处死动物,取标本进行扫描电镜分析、钙含量及碱性磷酸酶活性测定。主要观察指标:①扫描电镜分析结果。②碱性磷酸酶活性及钙含量。结果:①电镜照片结果:实验组的骨创愈合比对照组提前4～6周。②碱性磷酸酶活性:实验组均明显高于对照组[2周:(38.191±5.384),(19.821±2.084)μkat/g;4周:(160.815±9.669),(126.709±1.634)μkat/g;8周:(378.892±13.086),(225.212±1.884)μkat/g,P<0.01]。③钙含量:实验组均明显高于对照组[2周:(5.592±0.110),(0.913±0.064)mg/g;4周:(8.654±0.177),(1.702±0.071)mg/g;8周:(25.326±0.287),(5.980±0.145)mg/g,P<0.01]。结论:原核表达重组人骨形态发生蛋白7具有良好的增高牙槽嵴、促进拔牙创愈合的作用。

摘要：背景:骨形态发生蛋白(bonemorphogeneticprotein,BMP)是诱导和促进种子细胞向骨细胞方向转化的最重要的细胞因子之一。天然BMP难溶解于培养基,对培养的种子细胞无法有效发挥作用;可溶性重组BMP虽可溶解于培养基,但价格昂贵,而且难于适时、适量的作用于种子细胞。基因治疗为上述问题的解决提供了新的思路。目的:转染外源BMP-3基因入成纤维细胞,筛选获得稳定表达BMP-3的阳性成纤维细胞克隆。设计:单一样本研究。单位:解放军第四军医大学西京医院全军骨科研究所。材料:成纤维细胞(NIH3T3细胞)由第四军医大学口腔医学院司徒镇强教授提供。方法:2000-04/2003-11在全军重点实验室第四军医大学全军骨科研究所实验室完成。采用脂质体转染的方法将外源BMP-3基因转染入NIH3T3细胞,G418筛选后寻找细胞集落,分离、培养,免疫组织化学鉴定,BMP-3染色阳性者为阳性BMP-3表达细胞克隆。主要观察指标:①NIH3T3细胞筛选浓度。②转染阳性细胞克隆的筛选。③筛选的细胞克隆内BMP-3的表达。结果:成功将BMP-3基因转染入NIH3T3细胞,经免疫组化筛选出阳性BMP-3表达成纤维细胞的克隆,建立了BMP-3稳定表达成纤维细胞株。结论:将BMP-3基因真核表达载体转染入成纤维细胞,并经筛选获得了可稳定表达BMP-3的成纤维细胞株,为将来骨组织工?

摘要：背景:骨形成蛋白与骨、软骨、肌腱、韧带等多种组织的形成有关,血管内皮细胞生长因子通过提高血管的通透性和促进内皮细胞迁移可促进血管生成。目的:构建人骨形成蛋白2和人血管内皮细胞生长因子165的真核共表达载体,并观察其在骨髓间充质干细胞中的表达。设计:观察对比实验。单位:泸州医学院附属医院整形外科和中国医学科学院中国协和医科大学整形外科医院。材料:骨髓间充质干细胞来源于健康成人献髓志愿者。pIRES-EGFP-hVEGF165含人血管内皮细胞生长因子165全长cDNA序列,由中国医学科学院整形外科医院成挺博士提供。含人全长骨形成蛋白2cDNA序列的克隆载体pSP65-hBMP2,由军事医学科学院基础医学研究所郭希民博士提供。真核表达载体pIRESneo(Clontech公司)Pyrobest DNA Polymerase、限制性内切酶、DNA连接酶和质粒提取试剂盒、DNA片段分离及纯化试剂盒(大连宝生物公司),Lipofec-tamineTM脂质体转染试剂盒、DMEM培养基、胰蛋白酶、TRIzol RNA提取试剂盒(Gibco BRL),Omniscript RT试剂盒(Qiagen),Taqplus-DNA聚合酶(Promega),PMSF、leupeptin、aprotinin、chymostatin(Sig-ma),蛋白酶抑制剂、PVDF膜(Amersham-Pharmacia Biotech),兔抗人BMP2和VEGF单克隆抗体(Santa Cruz公司),羊抗兔IgG-过氧化物酶(博士德公司),G418(美国Ameresco公司)。方法:实验于2005-06/2006-04在泸州医学院附属医院和中国医学科学院中国协和医科大学整形外科医院完成。利用重组DNA和基因克隆技术将人骨形成蛋白2和人血管内皮细胞生长因子165cDNA定向克隆到载体pIRESneo的多克隆位点构建重组质粒,经Xho I/Bgl II双酶切和基因测序鉴定后,在阳离子脂质体介导下转染骨髓间充质干细胞,根据观察结果的需要,将转染的细胞分为IRES-hBMP2-VEGF165组,pIRES-hBMP2组,pIRES-VEGF165组,空质粒对照组,分别给予pIRES-hBMP2-VEGF165,pIRES-hBMP2,pIRES-VEGF165及pIRES-neo转染,取同样数量的未转染的细胞作为空白对照组。通过RT-PCR及Western blot检测细胞骨形成蛋白2和血管内皮细胞生长因子165mRNA表达和蛋白的分泌。主要观察指标:①重组质粒双酶切和基因测序分析。②RT-PCR观察质粒转染后的骨髓间充质干细胞的人骨形成蛋白2mRNA和人血管内皮细胞生长因子mRNA表达。③Western Blot检测质粒转染后的骨髓间充质干细胞的骨形成蛋白2和人血管内皮细胞生长因子蛋白分泌情况。结果:①重组质粒双酶切和基因测序分析结果:用EcoRI和Bgl II将三个阳性质粒和pIRES-BMP2进行双酶切鉴定与基因测序分析重组质粒的hBMP-2和hVEGF165与报道结果一致,证明重组质粒pIRES-hBMP2-hVEGF165构建成功。②RT-PCR检测结果:转染pIRES-hBMP2-hVEGF165的细胞高表达BMP2mRNA和VEGFmR-NA,而未转染的细胞和只转染空质粒的细胞则阴性或只有痕量表达。③Western Blot检测结果:转染pIRES-hBMP2-hVEGF165和pIRES-BMP2的细胞大量分泌人BMP2至上清,而转染pIRES-VEGF165或空质粒的细胞与未转染的细胞仅有极少量的BMP2分泌;转染pIRES-hBMP2-hVEGF165和pIRES-hVEGF165的细胞大量分泌血管内皮细胞生长因子至上清,而转染pIRES-hBMP2或空质粒的细胞与未转染的细胞仅有极少量的血管内皮细胞生长因子分泌。结论:重组质粒pIRES-hBMP2-hVEGF165真核共表达载体在人骨髓间充质干细胞细胞中有良好的表达。

摘要：背景:骨组织工程中一个重要的研究内容就是如何保持并提高成骨细胞的体内外成骨能力,采用基因转移技术有可能为此问题的解决提供一种新的有效方法。目的:探讨逆转录病毒介导的人骨形态发生蛋白7基因转染对兔骨髓间充质干细胞增殖和向成骨细胞分化的影响。设计:以细胞为研究对象,分组对照,重复观察测量。对象:实验于2001-07/2003-07在南方医科大学附属南方医院创伤骨科实验室完成。新西兰大白兔4只由第一军医大学动物实验中心提供,雌雄不拘,体质量1.0～1.5kg。方法:构建人骨形态发生蛋白7逆转录病毒载体,使用含目的基因的病毒液感染骨髓间充质干细胞,免疫组织化学方法检测人骨形态发生蛋白7蛋白的表达。四甲基偶氮唑盐法检测细胞增殖能力,使用流式细胞仪检测细胞周期,NPP法检测碱性磷酸酶合成情况。主要观察指标:主要结局:①细胞增殖检测结果。②碱性磷酸酶检测结果。次要结局:①转染骨髓间充质干细胞中人骨形态发生蛋白7蛋白的表达。②细胞周期检测结果。结果:经骨形态发生蛋白7基因转染的兔骨髓间充质干细胞免疫组织化学检测显示有人骨形态发生蛋白7的阳性表达。经人骨形态发生蛋白7基因转染的兔骨髓间充质干细胞增殖能力无明显改变(P>0.05)。经转染的骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶合成(294.592±86.567)

摘要：目的制备载人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)的甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐(dex-GMA)凝胶微球并初步考察其体外溶胀、降解、载药与释药特征。方法以液体石蜡为油相,Span-80为乳化剂,采用乳化化学交联技术制备载rhBMP-2的凝胶微球(BMP-HMs)并通过正交设计法优化其制备工艺;观察BMP-HMs形态和粒径,测定其包封率与载药量;用微球的吸水能力表示微球的溶胀率(Rs),扫描电镜观察微球的体外降解,动态观察体外释药特征及其与微球溶胀、降解的关系。结果所制备的BMP-HMs形态规整,粒径40～50μm,分布均匀;rhBMP-2载药量(10.6±4.8)%,包封率(88.9±1.0)%,BMP-HMs冻干剂4℃以下存放6个月性能稳定,但在磷酸盐缓冲液(PBS)中20～40d内可以完全降解。微球Rs随反应促进剂四甲基乙二胺(TEMED)用量的增大而减小,0.3mlTEMED制备的BMP-HMs体外释药实验表明80%的rhBMP-2在前20d左右释放。结论BMP-HMs对rhBMP-2具有确定的缓释作用,并可以通过制备工艺的改变控制其释药。

摘要：背景：转基因细胞移植可以提高成骨细胞数量及成骨活性，有可能成为骨缺损的重要修复方法。目的：构建人骨形态发生蛋白2真核表达载体，鉴定并转染兔骨髓基质细胞，应用基因治疗的方法修复兔桡骨缺损，观察其成骨效果。设计、时间及地点：单一样本观察及同体对照动物实验，于2004-06/2006-02在哈尔滨医科大学附属第一医院中心实验室完成。材料：克隆质粒psp-65BMP2为解放军第四军医大学171腔医院惠赠；pcDNA3．1表达载体购自Invitrogen公司；清洁级新西兰白兔32只，雌雄不限，体质量为2～2．5kg。方法：双酶切克隆载体将骨形态发生蛋白2目的基因与真核表达载体pcDNA3．1连接。将自体骨髓基质细胞修复兔桡骨缺损。分别于16只新西兰白兔缺损处植入载有转基因细胞的胶原，对侧植入单纯胶原对照。16只新西兰白兔缺损处植入载有自体细胞的胶原，对侧植入单纯胶原对照。主要观察指标：①免疫组织化学及Western blotting检测转染骨形态发生蛋白2基因骨髓基质细胞的表达效果。②术后12周麻醉后处死动物，行缺损处大体观察、X射线观察及组织学和电镜观察。结果：①成功构建骨形态发生蛋白2真核表达载体，转染骨髓基质细胞后，免疫组织化学染色，可在骨髓基质细胞胞浆显示棕色阳性染色：Western blotting检测有针对骨形态发生蛋白2抗体的蛋白条带，证实骨形态发生蛋白2表达。②组织学和电镜观察实验侧骨缺损处可见大量成骨细胞及新生基质。对照侧仅在断端间见少量骨细胞，断端处为纤维组织充填：转基因骨髓基质细胞修复骨缺损完全愈合：大体及X射线观察转染实验侧有连续骨痂通过骨缺损处，对照侧无连续骨痂通过断端。结论：骨髓基质细胞经基因转染后可以表达骨形态发生蛋白2，并可以修复骨缺损。