摘要：目的拟构建双顺反子增强型绿色荧光蛋白标记的人骨形态发生蛋白2fbonemorpho—geneticprotein-2，BMP2）真核表达载体，为其在真核细胞体内外示踪定位打下基础。方法以重组质粒pcDNA3．1／CT—hBMP2为模板，结合已设计好的特异性引物，采用PCR方法获得BMP2片段，将其分别与克隆载体pTA2-T-easy和真核表达载体pSELECT-GFPzeo—MCS连接，转化入感受态DH5（x细胞中，通过筛选得到含有绿色荧光蛋白的重组表达载体pSELECT—GFPzeo—hBMP2，并进行测序鉴定。将质粒转染CHO细胞后WesternBlot检测BMP2蛋白表达，用RT—PCR检测BMP2mRNA表达。结果琼脂糖电泳显示PCR产物为一条长约1216bp的带，重组表达载体pSELECT-GFPzeo—hBMP2经双酶切可得到约1216bp的片段，测序证实与Genebank中hBMP2序列完全相符，重组表达载体脂质体法转染CHO细胞48-72h后荧光显微镜下证实转染成功，经RT—PCR证实CHO细胞中存在BMP2基因表达，采用免疫荧光化学方法证实载体中CHO细胞表达BMP2蛋白。经WesternBlotting鉴定重组蛋白为分泌蛋白，相对分子质量在17×10^3左右。结论成功构建可体内外示踪增强含双顺反子绿色荧光蛋白人BMP2真核表达载体。

摘要：背景:目前,人们利用基因重组技术已经表达出人类基因重组骨形态发生蛋白2,并且在常位和异位成功地诱导出新骨。但由于重组人骨形态发生蛋白2比天然骨形态发生蛋白2的诱导成骨活性较低,且尚未找到十分理想的载体。目的:通过构建骨形成蛋白重组腺病毒,为骨缺损的基因治疗提供可行载体。设计:单一样本实验。单位:西安交通大学第一医院分子生物学实验中心。材料:PACCMV-PLPA质粒,PJM17质粒,293细胞系。方法:实验于2001-09/02-06在西安交通大学第一医院分子生物学实验中心完成。应用反转录-聚合酶链反应法克隆出骨形态发生蛋白质类2全长基因,构建重组腺病毒载体,DNA-磷酸钙共沉法将辅助质粒PJM17转染293细胞,同源重组构建出重组腺病毒。测滴度并用氯化铯梯度离心纯化备用。主要观察指标:①聚合酶链反应产物克隆结果。②PACCMV-BMP2穿梭质粒的鉴定结果。③重组腺病毒的构建结果。结果:①聚合酶链反应产物克隆结果:克隆构建的重组质粒命名为pGEM-T/hBMP2,大小为(3015+1213)bp。琼脂凝胶电泳结果显示实际值与理论值完全一致。②PACCMV-BMP2穿梭质粒的鉴定结果:质粒大小约为10Kbp,因PACCMV-PLPA质粒多克隆位点属PUC质粒系列,故用EcoRⅠ酶切,可将重组质粒线性化,大小为10Kbp。而EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切时,可得到8.8Kbp和1.2Kbp两个可见片段。③重组腺病毒的构建结果:重组病毒的鉴定应用聚合酶链反应技术,利用BMP2全长特异引物扩增出目的片段1.2Kbp,与理论值完全一致。结论:骨形态发生蛋白2重组腺病毒的构建成功为骨缺损等疾病的基因治疗奠定了可行的载体基础。

摘要：目的:利用骨形态发生蛋白2腺病毒转染向成骨细胞分化的骨髓基质细胞,在体外观察骨形态发生蛋白2的表达量和反应成骨细胞特性的指标变化。方法:实验于2002-04/12在北京大学第三医院中心实验室进行。6周龄雄性BALB/c小鼠60只用于骨髓基质细胞提取,小鼠骨髓基质细胞分别用Dulbecco改良的Eagle培养基液和骨诱导培养基(含地塞米松10-8mol/L、L-抗坏血酸50mg/L、β-甘油磷酸钠10mmol/LDulbecco改良的Eagle培养基液)培养。①不同量骨形态发生蛋白2腺病毒转染骨髓基质细胞的碱性磷酸酶比活性的比较:取原代培养的骨髓基质细胞,分别加入转染指数25,50,100,200骨形态发生蛋白2腺病毒,以不加骨形态发生蛋白2腺病毒的骨髓基质细胞作为对照。6d后收集细胞,测定碱性磷酸酶活性。②骨髓基质细胞诱导分化后转染骨形态发生蛋白2腺病毒的碱性磷酸酶比活性的比较:实验分5组:骨髓基质细胞组,用Dulbecco改良的Eagle培养基培养9d;骨诱导培养3d组,骨诱导培养3d改用Dulbecco改良的Eagle培养基培养6d;骨诱导培养9d组,骨诱导培养9d;骨诱导培养3d+骨形态发生蛋白2腺病毒组,骨诱导培养3d,加入转染指数50的骨形态发生蛋白2腺病毒作用6d;骨形态发生蛋白2腺病毒组,用Dulbecco改良的Eagle培养基培养3d,加入同量骨形态发生蛋白2腺病毒作用6d。收集细胞,测定碱性磷酸酶比活性。③骨形态发生蛋白2与骨桥蛋白检测:采用免疫组织化学染色与蛋白印迹方法。实验采用拉丁方设计。结果:应用骨诱导培养基或转染骨形态发生蛋白2腺病毒均使细胞碱性磷酸酶比活性明显增加(P0.05),显著高于骨诱导培养3d组和骨诱导培养9d组(P<0.05)。③骨形态发生蛋白2和骨桥蛋白检测结果:骨诱导培养3d+骨形态发生蛋白2腺病毒组两指标表达量均最高。结论:单纯用诱导Dulbecco改良的Eagle培养基以及先诱导培养再加入骨形态发生蛋白2腺病毒均可促进骨髓基质细胞向成骨细胞方向分化,但是骨髓基质细胞用骨诱导培养基作用3d再加入骨形态发生蛋白2腺病毒能分泌表达更多的骨形态发生蛋白2,从而提高了目的基因表达的效应。

摘要：背景:局部软组织条件不好的难治性骨缺损修复是临床的重大难题和亟待解决的问题。目的:探讨带血供肌瓣作为骨形态发生蛋白载体修复骨缺损成骨过程中骨骼肌的变化。设计:观察对比实验。单位:南方医科大学南方医院实验动物中心。对象:重组人骨形态发生蛋白2;清洁级健康新西兰大白兔20只,1.5～2.5kg,雌雄不拘。方法:实验于2000-01/2002-08在南方医科大学南方医院实验动物中心完成。取10只兔,制作兔桡骨下段15mm骨缺损,将指深屈肌肌瓣去神经后,转位至缺损区,将纤维蛋白与重组人骨形态发生蛋白2复合物植入肌瓣中。分别于1,2,4,6,8周麻醉状态下各处死4只兔,进行骨缺损区肌瓣大体观察、组织学、原位末端标记及超微结构观察。主要观察指标:兔桡骨缺损区肌瓣大体观察、组织学检查、原位末端标记法染色结果及超微结构。结果:20只兔均进入结果分析。①兔桡骨缺损区肌瓣大体观察结果:骨骼肌逐渐发生萎缩,8周时肌纤维几乎完全消失,新生骨组织呈条索状桥接两断端。②兔桡骨缺损区肌瓣组织学检查结果:组织学显示骨骼肌萎缩的同时,部分细胞核出现崩解,并有凋亡小体出现。③兔桡骨缺损区肌瓣细胞凋亡情况:原位末端标记法染色萎缩的骨骼肌纤维内大量显色阳性的细胞核或核碎片。④兔桡骨缺损区肌瓣超微结构:骨骼肌肌丝随时间延长逐渐消失,细胞核出现染色质边集、固缩、碎裂,呈典型的凋亡改变。结论:带血供肌瓣复合骨形态发生蛋白修复骨缺损成骨过程中,肌纤维逐渐发生萎缩、凋亡,最终被骨组织所替代。

摘要：背景:骨形态发生蛋白-2是高效骨诱导因子。骨形态发生蛋白-2诱导骨内、外膜和骨髓基质细胞分化为骨母细胞,有加强骨床再生能力的作用,还可以活化或诱导血管周围的间充质细胞分化为软骨和成骨细胞。目的:观察益骨胶囊预防和治疗用药对去卵巢骨质疏松大鼠骨组织骨形态发生蛋白-2蛋白表达的影响。设计:随机分组设计、对照实验。单位:暨南大学附属第一医院中医科。材料:实验于 2003-03/10在暨南大学中药学实验室完成。动物:选择10月龄普通级雌性 SD 大鼠 72只,体质量(380±20)g,由广东省医学实验动物中心提供(合格证号:粤检证字第 2002A024号)。随机抽取24只分为假手术(腹部切口但不切除卵巢)预防用药组(12只)和治疗用药组(12只),余 48只行腹部切口双侧卵巢切除术复制骨质疏松模型后随机分为 4组:模型预防用药组、模型治疗用药组、预防用药组、治疗用药组,每组 12只。药物:益骨胶囊由淫羊藿、枸杞子、熟地黄、牛膝等组成,深圳三九医药股份有限公司提供免煎颗粒,配制成水溶液,含生药 1.0g/m L。干预:益骨胶囊预防用药于手术后 3d 即开始灌胃,假手术预防用药组、模型预防用药组灌胃生理盐水 3m L、预防用药组灌胃益骨胶囊水溶液 3m L,1次 /d,共 24周;益骨胶囊治疗用药于手术后第 13周开始灌胃,假手术治疗用药组、模型治疗用药组灌胃生理盐水 3m L、治疗用药组灌胃益骨胶囊水溶液 3m L,1次 /d,共 12周。免疫组化方法检测骨组织骨形态发生蛋白-2蛋白表达。主要观察指标:骨组织骨形态发生蛋白-2阳性反应细胞的平均灰度值。结果:大鼠造模 24周时,模型预防用药组、预防用药组、假手术预防用药组大鼠骨组织骨形态发生蛋白-2阳性反应细胞的平均灰度值分别为81.84±10.01,124.46±6.55,130.15±10.09,模型预防用药组明显低于假手术预防用药组 (P 0.05)。模型治疗用药组、治疗用药组、假手术治疗用药组大鼠骨组织骨形态发生蛋白-2阳性反应细胞的平均灰度值分别为 77.97±10.35,110.32±8.69,131.79±12.10,模型治疗用药组明显低于假手术治疗用药组(P 0.05)。结论:益骨胶囊预防和治疗用药均能促进骨组织骨形态发生蛋白-2蛋白表达。

摘要：背景:骨髓间充质干细胞依赖特定的生长和分化因子能分化为骨、软骨、脂肪等不同组织。人重组骨形态发生蛋白2有明显的骨诱导作用,能诱导未分化的骨髓间充质干细胞不可逆地形成骨与软骨,并最终导致新骨生成;碱性成纤维生长因子亦参与调控骨髓间充质干细胞的软骨与骨的分化。目的:观察碱性成纤维生长因子和人重组骨形态发生蛋白2对兔骨髓间充质干细胞增殖和分化的影响,以便寻求合适的骨形成诱导方法以代替常规的成骨培养体系。设计:随机对照实验。单位:解放军第四军医大学唐都医院骨肿瘤研究所。材料:培养的兔骨髓间充质干细胞。方法:实验于2004-06/12在第四军医大学唐都医院骨肿瘤研究所暨全军骨科中心完成。①体外培养的兔骨髓间充质干细胞分别经3种不同的生长因子(100μg/L人重组骨形态发生蛋白2,100μg/L碱性成纤维生长因子,100μg/L人重组骨形态发生蛋白2加100μg/L碱性成纤维生长因子)和成骨培养体系处理。②其增殖和分化通过四甲基偶氮唑盐比色法,碱性磷酸酶、骨钙素检测和钙结节VonKossa染色观察。主要观察指标:通过检测增殖率和碱性磷酸酶活性比较不同生长因子对兔骨髓间充质干细胞增殖和分化的影响。结果:①人重组骨形态发生蛋白2能促进兔骨髓间充质干细胞的增殖和分化,特别是其分化。②碱性成纤维生长因子能刺激兔骨髓间充质干细胞的增殖,与对照组相比,细胞增值率提高近100%;虽然对兔骨髓间充质干细胞分化无明显影响,但其能促进人重组骨形态发生蛋白2对兔骨髓间充质干细胞分化。结论:碱性成纤维生长因子和人重组骨形态发生蛋白2是兔骨髓间充质干细胞有效的分化因子,两者在体外都能促进兔骨髓间充质干细胞的增殖和分化。碱性成纤维生长因子和人重组骨形态发生蛋白2能协同作用加速骨诱导及骨形成,可以用作分化骨组织工程中的种子细胞。

摘要：背景:骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能,与可降解的多孔β-磷酸三钙陶瓷复合后具有修复节段性骨缺损的能力,为临床上修复各种原因导致的骨缺损提供了新的思路。目的:从放射学角度探讨用多孔β-磷酸三钙和自体骨髓间充质干细胞复合植入羊体内修复标准性骨缺损的效果。设计:以骨折愈合不同时期的骨痂生长情况为观察对象的随机对照。单位:武汉大学人民医院骨科,解放军军事医学科学院基础医学研究所组织工程中心。材料:实验于2002-03/2003-09在解放军军事医学科学院基础医学研究所组织工程中心完成。选取健康成年中国绵羊20只,随机分为空白对照组4只,单纯植入组8只,复合植入组8只。方法:全麻无菌条件下,抽取羊骨髓10～15mL,分离并培养出间充质干细胞,与多孔β-磷酸三钙陶瓷复合,构建组织工程化骨。各组动物均在跖骨中段锯取21mm长的跖骨干缺损,复合植入组植入β-磷酸三钙陶瓷与自体间充质干细胞复合体,单纯植入组植入β-磷酸三钙陶瓷,空白对照组缺损区空缺,然后逐层缝合。分别在术后即刻及1,3,6个月摄片观察,进行放射影像学评估(骨缺损区每面骨连接形成即得1分,在缺损区的任一面上均无骨连接为0分,缺损区的前、后、侧面及中央均形成骨连接为4分),图像分析X线阻射密度比较骨缺损的修复情况。主要观察指标:各组绵羊术后一般情况及大体观察、骨缺损区放射学分析结果。结果:实验纳入绵羊20只,全部进入结果分析。①各组绵羊术后一般情况:术后2～6h苏醒,切口无感染,内固定无松动。术后1周精神已逐渐恢复正常,伤肢能落地,但不能负重,2周后可以部分负重,3周有轻微跛行,4周后能自由活动,无跛行。②各组绵羊术后6个月大体观察结果:单纯植入组植入物表面白色的透明软骨样组织逐渐钙化,两端有骨桥与宿主骨相连,但仍可见有陶瓷材料颗粒存在;复合植入组植入物已不见,材料与宿主骨的界面消失,骨缺损部与宿主骨基本一致。空白对照组在术后各时间点均无骨组织形成。③各组绵羊术后不同时间骨缺损区放射学评分比较:复合植入组术后3,6个月均明显高于单纯植入组[(2.3±0.3),(1.8±0.5);(3.3±0.5),(2.6±0.6)分,P均<0.05]。④各组绵羊术后不同时间骨痂厚度与阻射密度相对值测量结果:复合植入组术后6个月骨痂厚度明显低于单纯植入组(4.62,7.64,P<0.05),阻射密度相对值明显高于单纯植入组(70.4±1.5,61.18±1.2,P<0.05)。结论:放射学评估及骨缺损密度测量能够较好地反映骨缺损修复的动态发展过程,多孔β-磷酸三钙陶瓷和自体骨髓间充质干细胞复合植入羊体内,可使大节段骨缺损较快得到修复。

摘要：背景:已证实甲壳质及其衍生物具有免疫调节、促进伤口愈合、止血等生物学作用,N-乙酰氨基葡萄糖作为甲壳质的衍生物,是否能够产生对骨折愈合的影响。目的:在骨折修复过程中介入N-乙酰氨基葡萄糖,观察成骨细胞活动和骨形态发生蛋白的变化。设计:随机对照实验.单位:青岛大学医学院的人体解剖学教研室。材料:实验于2002-03/08在青岛大学医学院神经解剖实验室完成。选用健康新西兰兔70只,随机分为3组:生理盐水组23只,接骨片组23只,N-乙酰氨基葡萄糖组24只。方法:所有动物均制备右桡骨中段3mm骨缺损模型,模型建立后生理盐水组给予生理盐水1.00mL/kg,接骨片组给予接骨片1.00mL/kg,N-乙酰氨基葡萄糖组给予N-乙酰氨基葡萄糖0.28g/kg,每天灌胃给药,直至取材为止。分别于术后9,17,30,42d进行取材。通过X-线片与苏木精-伊红染色观察各组骨折愈合情况,骨形态发生蛋白的表达采用免疫组织化学法观察。主要观察指标:①各组动物术后大体情况。②术后不同时间各组骨折愈合X线观察结果。③术后不同时间各组骨缺损断端间骨形态发生蛋白表达的平均吸光度值。④术后不同时间各组组织形态学观察结果。结果:按意向处理分析,实验纳入70只兔均进入结果分析。①术后不同时间各组骨折愈合评级X线观察结果:术后9,17,30,42dN-乙酰氨基葡萄糖组骨折愈合程度均高于生理盐水组和接骨片组(P均<0.05)。②术后不同时间各组骨缺损断端间骨形态发生蛋白表达的平均吸光度值:与生理盐水组比较,术后9,17d接骨片组与N-乙酰氨基葡萄糖组骨形态发生蛋白的表达均呈上升趋势,N-乙酰氨基葡萄糖组尤为明显(P均<0.05);而术后30,42d时骨形态发生蛋白的表达降低。③术后不同时间各组组织形态学观察结果:术后9d,N-乙酰氨基葡萄糖组断端间隙变小,有比较均匀的骨小梁形成,成骨细胞排列较整齐;生理盐水组断端间隙较大,少有或偶有不均匀的骨小梁形成,成骨细胞无或极少。术后30d,N-乙酰氨基葡萄糖组断端之间全部为骨小梁填充,骨髓腔骨小梁将要穿通,骨小梁周围成骨细胞排列整齐间有破骨细胞;生理盐水组断端之间大部分为骨小梁,但有中间部分未衔接,断端间软骨细胞极少。术后42d,N-乙酰氨基葡萄糖组断端处骨板编织骨初始形成,骨髓腔贯通,破骨细胞多而活跃,有骨小窝;生理盐水组断端之间充满骨小梁,但连接线不清,髓腔将要贯通,成骨细胞排列较为整齐,有破骨细胞出现。结论:N-乙酰氨基葡萄糖能够促进骨折的愈合,可能与其促进成骨细胞活性和早期增加骨形态发生蛋白在骨折愈合中的表达有关。

摘要：目的比较腺病毒和慢病毒载体感染骨髓间质干细胞(rMSCs)的荧光病毒基因表达的稳定性及持续时间。方法将含有绿色荧光蛋白(GFP)基因的慢病毒载体质粒同辅助质粒一起共感染293T细胞,重组包装;将慢病毒和腺病毒载体分别感染rMSCs,培养5周,分别在1、3、5周通过流式细胞仪检测GFP的表达情况。从GenBank中调出人骨形态发生蛋白2(hBMP2)基因序列,设计带有NheI、AgeI双酶切位点引物。从人肝脏组织中抽提总RNA,再逆转录成cDNA,扩增出hBMP2基因的全长序列。测序验证后克隆到慢病毒载体pHIV-CS-CDF-CG-PRE上,通过PCR扩增、酶切、测序等方法鉴定重组慢病毒载体。将该重组慢病毒载体质粒同辅助质粒一起共感染293T细胞,通过重组而包装成能表达hBMP2基因的有活性的慢病毒。结果两种病毒载体感染后1周,绿色荧光蛋白表达分别是90%和71%,到5周时,慢病毒载体的绿色荧光蛋白表达明显高于腺病毒载体,分别是79%和0.05%。扩增出1.2kb左右的hBMP2全长基因与GeneBank中的hBMP2阅读框架序列完全一致;成功克隆和构建了含hBMP2基因的慢病毒载体pHIV-hBMP2;对慢病毒载体进行了成功包装和分析。结论含hBMP2基因的慢病毒载体可成功构建。慢病毒载体对大鼠骨髓间质干细胞的转染效率明显优于腺病毒载体。

摘要：背景:模拟失重条件下,骨形态发生蛋白2诱导的大鼠骨肉瘤成骨样细胞(ROS17/2.8)的Ⅰ型胶原α1链的基因表达下降,而丝裂原激活的蛋白激酶信号传导通路中的蛋白激酶MEK1参与了骨形态发生蛋白2对成骨细胞Ⅰ型胶原α1链mRNA表达的调节过程,但是在模拟失重条件下MEK1的活性如何变化尚不清楚。目的:观察模拟失重条件下由骨形态发生蛋白2诱导的ROS17/2.8细胞中MEK1激酶活性的变化。设计:不完全随机对照的实验。单位:解放军第四军医大学航空航天生物动力学教研室。材料:大鼠骨肉瘤成骨样细胞。方法:实验于2002-08/2003-01在北京航天医学工程研究所航天细胞与分子生物学实验室完成。在地面1G和回转器模拟失重条件下培养ROS17/2.8细胞,培养时间分别为24,48和72h。分为7组:第1组,空白对照组,即1G条件下不加骨形态发生蛋白2培养24h;第2组,1G培养24h;第3组,失重培养24h;第4组,1G培养48h;第5组,失重培养48h;第6组,1G培养72h;第7组,失重培养72h;第2组至第7组均加入骨形态发生蛋白2。培养结束前1h加入骨形态发生蛋白2(500mg/L),1h后提取细胞蛋白,应用WesternBlotting法检测MEK1的活性。主要观察指标:观察细胞中的总ERK1/2和磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)的含量。结果:①模拟失重条件下骨形态发生蛋白2诱导后ROS17/2.8细胞的总ERK1/2的表达:各实验组细胞的总ERK1/2蛋白表达量无明显差异。②模拟失重条件下骨形态发生蛋白2诱导后ROS17/2.8细胞的磷酸化ERK1/2的表达:第1组,细胞培养液中不含骨形态发生蛋白2在1G重力条件下培养24h,p-ERK1/2呈低水平表达,第2组,即培养液中加入骨形态发生蛋白2在1G条件下培养24h,p-ERK1/2的表达量明显高于第1组(P<0.01)。各模拟失重组p-ERK1/2表达量均低于相同时间点1G重力对照组,即第3,5,7组的表达分别低于第2,4,6组(P<0.01),且随着失重时间延长,第3,5,7组的p-ERK1/2表达量呈逐渐降低的趋势(P<0.01)。结论:模拟失重条件下骨形态发生蛋白2诱导的成骨细胞丝裂原激活的蛋白激酶信号通路中蛋白激酶MEK1的活性下降。