摘要：目的:观测骨桥蛋白靶向干扰RNA对体外人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖和凋亡的影响。方法:体外化学合成骨桥蛋白序列特异性的短发夹RNA(shRNA)质粒载体与阳离子脂质体结合介导转染HUVEC,同时设计空白载体转染对照和空白对照,用MTT法等方法检测各组HUVEC生长增殖情况的变化,并用流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果:OPN-shRNA载体转染HUVEC后明显抑制细胞增殖(P<0.05)和使细胞分裂周期出现阻滞,凋亡二倍体数量增加,凋亡率显著升高(P<0.05)。结论:骨桥蛋白靶向干扰RNA在体外能够抑制HUVEC的增殖,升高细胞凋亡率。

摘要：目的 探讨表皮生长因子（EGF）对U87细胞增殖和侵袭能力的影响及其可能的作用机制.方法 设计合成骨桥蛋白（OPN）特异性siRNA并转染U87细胞株,以下调细胞中OPN的表达.设立空白对照组、EGF组以及siRNA＋ EGF组.采用实时定量PCR （qPCR）和Western blot方法检测OPN在各组细胞中的表达,以MTT法和Transwell实验分别检测各组细胞的增殖能力和侵袭能力.结果 siRNA可成功转染至U87细胞并抑制OPN的表达,使OPN蛋白的表达水平下降50.7％（P＜0.05）.qPCR和Western blot结果显示,与空白对照组比较,EGF组和siRNA ＋EGF组OPN的表达均增加（均P ＜0.05）,但EGF组表达的上调更显著;与EGF组相比,siRNA ＋EGF组OPN的表达明显减少（P＜0.05）.MTT实验表明,与空白对照组相比,EGF组和siRNA＋ EGF组的细胞增殖均明显增强（均P＜0.05）;与EGF组相比,siRNA＋ EGF组的细胞增殖明显受到抑制（P＜0.05）.Transwell实验结果显示,与空白对照组相比,EGF组和siRNA＋ EGF组的细胞侵袭能力均显著增加（均P＜0.05）;与EGF组相比,siRNA＋ EGF组细胞的侵袭能力明显降低（P＜0.05）.结论 EGF可通过上调OPN的表达增强胶质瘤细胞的增殖和侵袭能力.

摘要：目的 构建携带骨桥蛋白双链小干扰RNA（OPN-siRNA）的质粒表达载体,筛选出基因沉默效果最明显的短发卡样RNA（shRNA）质粒表达载体.方法 设计并合成2个针对OPN的shRNA寡核苷酸片段（shRNA1,shRNA2）,退火形成双链并分别克隆进入载体pGenesil-1.酶切鉴定后,采用LipofectamineTM2000介导的转染方法将重组的shRNA质粒转入大鼠血管平滑肌细胞（VSMC）,筛选出稳定转染株.采用RT-PCR及Western免疫印迹检测其对OPN表达的抑制效果.结果 shRNA质粒成功转染入VSMC且效率达50%以上.转染含OPN shRN A1的VSMC的OPN mRNA和蛋白的表达分别为0.16±0.04和0.30±0.09,含OPN shRNA2分别为0.23±0.06和0.44±0.06,两组之间及分别与正常细胞组比较差异均有统计学意义（P〈0.01）.空载体组和阴性对照组与正常细胞组比较,差异均无统计学意义（P〉0.05）.结论 成功构建了靶向OPN基因的shRNA质粒表达载体,其中抑制效果最为明显的shRNA质粒表达载体为shRN A1质粒.

摘要：目的:通过构建慢病毒介导的骨桥蛋白(OPN)基因沉默shRNA载体,并转染人肺腺癌细胞A549建立OPN基因稳定沉默的肺癌细胞株,为进一步研究OPN与非小细胞肺癌侵袭转移相关分子机制奠定细胞学基础。方法:设计靶向OPN基因的3条siRNA靶点系列,分别合成含有干扰系列的shRNA,与双酶切后的pLVXshRNA2-puro载体连接,构建pLVX-shRNA2-puro-OPN1、pLVX-shRNA2-puro-OPN2和pLVX-shRNA2-puro-OPN3病毒载体,并转化于DH5ɑ感受态细胞,挑阳性克隆质粒测序,通过转染293T细胞,获取慢病毒颗粒,转染人肺腺癌细胞A549,用含嘌呤霉素培养基筛选培养,应用定量PCR及Western Blot检测OPN基因沉默效果,选用沉默效果最佳的pLVX-shRNA2-puro-OPN1建立OPN基因稳定沉默细胞株,并用transwell方法检测各组肺癌细胞株的侵袭能力。结果:经测序鉴定成功构建pLVX-shRNA2-puro-OPN慢病毒载体,定量PCR及Western Blot检测发现转染pLVX-shRNA2-puro-OPN-1、pLVX-shRNA2-puro-OPN2慢病毒载体可明显降低A549细胞株中的OPN mRNA及蛋白水平; OPN基因稳定沉默明显抑制A549细胞株的侵袭能力。结论:成功构建pLVX-shRNA2-puroOPN慢病毒载体,OPN基因稳定沉默明显抑制A549细胞株的侵袭能力。