摘要：辅助化疗和新辅助化疗使骨肉瘤患者5年生存率从35年前的不足20％提高到现在的60％以上。骨肿瘤的化疗可以追溯到1961年。但直到Rosen、Jaffe等相继将阿霉素、甲氨蝶呤用于骨肉瘤的治疗，骨肉瘤辅助化疗（术后化疗）才真正拉开了序幕。但近15年来，骨肉瘤生存率处于平台期，为此，国际上众多研究机构设计进行了许多临床试验，试图进一步提高其生存率，本文结合这些试验，对骨肉瘤化疗中存在的几个热点问题进行综述。

摘要：目的探讨应用胫骨下段3D打印踝关节融合型肿瘤假体重建胫骨下段恶性骨肿瘤切除后骨缺损的安全性和早期临床疗效。方法自行设计胫骨下段3D打印踝关节融合型肿瘤假体,假体远端的组配节段与距骨和腓骨远端接触面为3D打印金属骨小梁界面,通过锥接的组配式节段调节假体长度。2017年12月至2019年12月在肿瘤切除术中应用3D打印踝关节融合型肿瘤假体的胫骨下段骨肉瘤患者8例,男5例、女3例;年龄(16.1±7.4)岁(范围8~29岁)。包括骨母细胞型骨肉瘤7例、毛细血管扩张型骨肉瘤1例,Enneking分期均为ⅡB期。在规范术前化疗后行肿瘤广泛切除术,以3D打印踝关节融合型肿瘤假体重建胫骨下段骨缺损。术后6个月内配戴支具行走,6个月后配戴护踝行走。术后每个月行X线检查评估踝关节融合情况,融合完成后每3个月随访一次直至2年,观察并发症发生情况及肿瘤学预后。采用骨骼肌肉肿瘤协会(Musculoskeletal Tumor Society,MSTS)评分评估术后功能。结果胫骨下段肿瘤均毗邻踝关节,均按照术前计划完成截骨,截骨长度为(16.0±3.1)cm(范围11~20 cm),肿瘤切除获得广泛外科边界。假体近端髓腔固定方式:3D打印金属骨小梁柄1例,自体腓骨移植1例,骨水泥固定6例。手术时间为(128.8±18.9)min(范围110~170 min),术中出血量为(125.0±37.8)ml(范围100~200 ml)。全部病例获得随访,随访时间为(15.6±10.5)个月(范围7~39个月)。假体远端与距骨均完全融合,融合时间为(4.3±0.7)个月(范围3~5个月)。随访期间未见肿瘤复发和转移、无伤口并发症和假体松动,全部患者均无瘤生存。末次随访时MSTS评分为84.2%±3.0%(范围80%~90%)。结论胫骨下段3D打印踝关节融合型肿瘤假体重建胫骨下段恶性骨肿瘤切除后的骨缺损安全、有效,融合率高,术后早期功能满意。

摘要：目的获得与骨肉瘤细胞株os-732特异结合的短肽,作为骨肉瘤靶向治疗的先导化合物。方法以骨肉瘤细胞os-732为靶细胞,成骨细胞为吸附细胞对噬菌体12肽库进行差减筛选,用细胞ELISA、免疫组化鉴定阳性噬菌体克隆并测序。结果经三轮筛选,从随机挑选的20个噬菌体克隆中得到9个能特异性与骨肉瘤细胞os-732结合,而不与正常成骨细胞结合的阳性克隆。但其氨基酸序列无同源性。结论得到多个序列不同的特异性结合骨肉瘤的噬菌体克隆,提示骨肉瘤细胞表面结构复杂,具多个骨肉瘤抗原表位。本实验获得的短肽具有一定的亲合力和肿瘤特异性,为针对不同位点的靶向药物设计提供了实验依据。

摘要：目的:研究骨肉瘤MG-63细胞中Ⅱ型谷氨酰胺转氨酶(TG2)的抗凋亡作用,探讨其抑制肿瘤细胞凋亡的机制。方法:设计针对TG2的siRNA,建立骨肉瘤MG-63细胞体外缺氧培养模型,分为常氧组(细胞在常氧下培养)、单纯缺氧组(细胞在缺氧培养箱里培养)、对照siRNA缺氧组(转染对照siRNA后在缺氧培养箱里培养)和TG2siRNA缺氧组(转染TG2siRNA后在缺氧培养箱里培养)。观察各组骨肉瘤MG-63细胞在缺氧培养不同时间(6、12、24、48和72h)后Bax和Cyt C的表达及细胞凋亡率。微量滴定法检测TG2活性,RT-PCR法检测TG2和Bax mRNA表达水平,免疫组织化学法检测TG2和Bax蛋白在细胞内的分布,Western blotting法检测TG2、Bax和Cyt C蛋白表达水平,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果:与常氧组比较,单纯缺氧组和对照siRNA缺氧组细胞TG2活性、TG2mRNA和蛋白表达水平明显增强(P0.05),但Bax蛋白表达水平明显下降(P0.05)。与单纯缺氧组和对照siRNA缺氧组比较,TG2siRNA缺氧组细胞各时间点TG2mRNA和蛋白表达水平明显降低(P0.05),Bax蛋白表达明显增加(P<0.01),胞浆内Cyt C蛋白水平明显增加(P<0.01),线粒体内Cyt C蛋白水平明显降低(P<0.01),细胞凋亡率显著增加(P<0.01)。结论:TG2通过与Bax形成混合物而消耗Bax,阻止Cyt C释放至胞浆,从而抑制肿瘤细胞凋亡。

摘要：骨肉瘤是最常见的原发性恶性骨肿瘤,治疗的主要方式和患者预后在近30年来相对停滞不前。随着越来越多骨肉瘤分子特征的揭示,骨肉瘤靶向治疗,如酪氨酸激酶抑制剂和细胞周期相关系列靶点抑制剂等的临床前研究与临床试验取得重要进展。周期检查点激酶1(checkpoint kinase 1,CHEK1)参与细胞DNA损伤应答,发挥着不可或缺的多种生物学功能,其特异性抑制剂的开发与研究在多种恶性肿瘤治疗领域的报道逐渐增多。骨肉瘤的多个亚群存在特征性改变,主要影响细胞周期和DNA损伤应答,特别是p53突变细胞可能对CHEK1抑制剂更敏感。设计靶向CHEK1相关途径的策略可能使患者受益。共济失调毛细血管扩张突变激酶(ataxia telangiectasia mutated,ATM)和(或)共济失调毛细血管扩张症和Rad3相关激酶(ataxia telangiectasia and rad3-related,ATR)抑制剂能干扰骨肉瘤细胞DNA损伤修复,使下游CHEK1相关分子成为潜在治疗靶点。抑制CHEK1能下调相关蛋白表达,抑制细胞增殖和修复,且与化疗药物联合效果明显。单用化疗药物效果常受限制,CHEK1抑制剂如Prexasertib可增强其对骨肉瘤细胞的杀伤作用,单独使用或与其他药物联合应用具有良好效果。将CHEK1抑制剂与其他细胞周期药物联合使用可能更具价值,或与其相关下游靶点抑制剂联合用药可提高疗效。此外,调控DNA损伤应答途径也可能与免疫治疗有关,靶向其相关的DNA损伤应答途径在骨肉瘤的治疗中具有潜在的应用前景。

摘要：目的研究 siRNA 对骨肉瘤 MG-63细胞株及正常成纤维细胞细胞周期蛋白 cyclin A2基因表达的抑制及对细胞增殖的影响。方法设计并化学合成靶向 cyclinA2基因的 siRNA,用oligofectamine 将其转染到骨肉瘤细胞系 MG-63及正常人成纤维细胞(HSF)中,用无义 siRNA 转染作为阴性对照,以单加缓冲液磷酸盐缓冲液(PBS)作为空白对照,实时-聚合酶链反应(PCR)、Western印迹方法检测 cyclinA2基因沉默效果,采用 MTT、RT-PCR、流式细胞、平板克隆培养等方法评价cyclinA2基因表达后被抑制后细胞的生长状态,同时检测细胞 PCNA 及 cyclinB1基因表达的改变。结果 1、10、50、100 nmol/L 浓度的 cyclinA2-siRNA 分别使 MG-63细胞 cyclinA2基因表达降低了9.4%,56.4%,79.2%和84.3%,同时 cyclinA2蛋白表达也相应降低。转染10 nmol/L及50 nmol/LsiRNA 后48 h,MG-63细胞增殖抑制分别达到39.1%及54.9%,细胞周期阻滞于 G0/G1期,平板克隆形成率降低,细胞中增殖细胞核抗原(PCNA)及 cyclinB1的 mRNA 表达水平明显下降。对正常成纤维细胞 HSF,50 nmol/L cyclinA2-siRNA 可抑制58.1%的 cyclinA2基因及蛋白表达,其导致细胞周期出现轻度改变,但细胞的增殖及平板克隆形成能力未受影响。结论 cyclinA2是肿瘤细胞增殖所依赖的关键基因,针对 cyclinA2基因的 siRNA 能有效降低细胞中 cyclinA2 mRNA 及蛋白的表达,其能抑制骨肉瘤细胞的生长而对正常细胞的增殖影响很小,靶向 cyclinA2的 siRNA 有望成为治疗骨肉瘤的新途径。

摘要：目的：体外建立骨肉瘤多药耐药模型（Ｒ－ＯＳ－７３２）。方法：小剂量递增阿霉素浓度与骨肉瘤细胞（ＯＳ－７３２）连续培养，使阿霉素浓度达３０ｎｇ／ｍｌ，总体培养６个月，共传代４９次，初步建立体外骨肉瘤多药耐药模型（Ｒ－ＯＳ－７３２）。应用组织学技术判断Ｒ－ＯＳ－７３２和ＯＳ－７３２细胞的形态学差异。应用免疫组化技术检测Ｐ－糖蛋白（Ｐ－１７０蛋白）、拓扑异构酶－Ⅱ（ＴＯＰＯ－Ⅱ）、谷胱甘肽－巯基转移酶（ＧＳＴ）在Ｒ－ＯＳ－７３２和ＯＳ－７３２细胞中的表达。应用ＭＴＴ比色法测定阿霉素（ＤＯＸ）、长春新碱（ＶＣＲ）、氨甲喋呤（ＭＴＸ）、鬼臼乙甙（ＶＰ－１６）、环磷酰胺（ＥＸ）对Ｒ－ＯＳ－７３２和ＯＳ－７３２细胞活性的影响，并用Ｏｒｉｇｉｎ统计软件的直线回归方程推算相应的ＩＣ５０值，同时进行统计学处理。结果：形态学上两组细胞无明显差异，Ｐ－１７０蛋白、ＧＳＴ在ＯＳ－７３２细胞中呈阴性表达，而ＴＯＰＯ－Ⅱ呈弱阳性；在Ｒ－ＯＳ－７３２细胞中，Ｐ－１７０蛋白、ＧＳＴ、ＴＯＰＯ－Ⅱ均呈阳性表达。ＤＯＸ、ＶＣＲ、ＭＴＸ对Ｒ－ＯＳ－７３２细胞的ＩＣ５０值均高于ＯＳ－７３２细胞（Ｐ＜０．０５），而ＶＰ－１６、ＥＸ对两组细胞的ＩＣ５０?

摘要：目的:观察缺氧诱导因子HIF-1α反义寡核苷酸(antisenseoligonucleotides,ASODN)在缺氧环境下对骨肉瘤细胞系MG-63HIF-1α和血管内皮生长因子VEGF表达的影响。方法:设计针对HIF-1αRNA亚基模板序列的反义﹑正义寡核苷酸(senseoligodeoxynucleotides,SODN),并建立骨肉瘤细胞体外缺氧培养模型,观察缺氧培养不同时相HIF-1α反义寡核苷酸对骨肉瘤细胞系MG-63HIF-1α和VEGF的表达的影响。RT-PCR方法检测HIF-1α和VEGFmRNA水平,免疫组化和免疫印迹方法检测HIF-1α和VEGF蛋白表达情况。结果:与常氧组比较,单纯缺氧组及SODN缺氧组的HIF-1α转录水平未见明显改变,蛋白表达水平却随缺氧时间延长明显升高;而VEGFmRNA以及蛋白的表达水平较常氧组均显著增强。然而在ASODN缺氧组,HIF-1α、VEGFmRNA活性以及蛋白的表达水平明显减弱,且HIF-1α蛋白水平与VEGF转录活性有明显的相关性。结论:在缺氧环境下,转染HIF-1α反义寡核苷酸能够抑制HIF-1α活性,从而使VEGFmRNA和蛋白的表达水平明显下降。

摘要：目的:通过构建携带针对miR-194的慢病毒沉默及过表达载体,研究miR-194对骨肉瘤细胞转移的影响。方法:以miR-194前体及成熟体序列为模板,设计引物,进行PCR扩增,酶切后克隆于慢病毒载体plent-i GFP中,转染293T细胞,包装慢病毒颗粒,检测滴度,最终对人骨肉瘤细胞系U2-OS进行感染。获取稳定感染细胞后,进行Transwell、划痕等实验。结果:1)慢病毒表达质粒构建成功,沉默表达及过表达重组慢病毒的滴度分别为4×108TU/mL及1.5×108TU/mL;2)稳定过表达miR-194的人骨肉瘤细胞系U2-OS的转移能力较其他组有明显降低(P<0.01)。结论:成功构建了miR-194慢病毒表达载体,miR-194的表达水平对U2-OS细胞的转移能力具有显著影响,miR-194可能成为骨肉瘤治疗的潜在新靶点。

摘要：目的 探讨可延长半关节假体置换治疗儿童下肢骨肉瘤术后假体相关并发症发生原因及防治策略。方法 2006年5月-2012年10月,共11例下肢骨肉瘤患儿行瘤段切除、可延长半关节假体置换术。男6例,女5例;年龄7-12岁,平均9.3岁。股骨远端6例,股骨近端2例,胫骨近端3例。病程2-8个月,平均3.6个月。根据Enneking分期：ⅡA期3例,ⅡB期8例。术前肺部CT和ECT检查示,肿瘤无转移及多发。术前全部患儿接受4次化疗。结果 术后10例切口Ⅰ期愈合,1例术后1周发生感染,经对症处理后愈合。术后9例接受12次化疗,另2例分别接受了2次和4次化疗。1例因局部复发后多处转移死亡;3例出现肺转移,其中2例死亡,另1例切除单发肺转移灶后存活。存活的8例患儿获随访25-89个月,平均42.5个月。1例股骨近端假体发生松动并脱位,3例股骨远端假体分别发生松动下沉、半脱位、延长后退缩;假体相关并发症发生率为50%。存活患儿中3例接受1次延长术,1例2次延长术;其余4例尚未行延长术。末次随访时,根据Enneking肢体恶性肿瘤保肢术后功能评价标准,获优1例,良3例,可3例,差1例,优良率为50%。结论 可延长半关节假体置换治疗儿童下肢骨肉瘤术后,存在假体松动下沉、脱位、关节不稳、延长后退缩等假体相关并发症,在提高假体设计、制造水平的同时术中骨水泥、人工补片及术后限制性支具的使用,可减少假体相关并发症发生。