摘要：背景:在多种移植细胞中,成体自身骨髓单个核细胞以其取材简便、无排异反应、无伦理学争议等优势成为具有临床应用价值的细胞来源。干细胞移植后,如何从受体辨别供体细胞,并观察其在受体中的生存状况,一直是让人困扰的问题。目的:应用超顺磁性氧化铁颗粒标记小型家猪骨髓单个核细胞,观察磁共振成像示踪磁探针标记细胞的可行性。设计:对照观察实验。单位:东南大学附属中大医院心血管病研究所。材料:实验于2006-04/2006-08在东南大学心血管病研究所完成。健康中国小型雄性家猪,三四月龄,体质量20～30kg,由东南大学实验动物中心提供(SYXK(苏)2002-0012)。方法:分离培养小型家猪自体骨髓单个核细胞,采用超顺磁氧化铁颗粒对骨髓单个核细胞分离当日细胞悬液中进行标记,普鲁士蓝染色显示细胞内铁,台盼蓝拒染法评估细胞活力。将11只用于心肌梗死模型制备的猪分为实验组9只和对照组2只。选择经皮行左或右颈动脉或股动脉穿刺途径,以1.5～2.0mm球囊封堵左前降支下1/3,304～405kPa,持续封堵60min后,术前反复予缺血预适应三四次。由猪体表心电图证实心肌梗死模型成功后,经皮冠脉内骨髓单个核细胞输注:梗死模型建立24h后,经皮股动脉穿刺行冠脉造影,应用OTW导管冠脉内输注骨髓单个核细胞细胞悬液,然后将盛放细胞的注射器及OTW导管以肝素生理盐水冲洗注入残余细胞,注射时间10min,对照组2只猪经同样方法注入未标记细胞。术后磁共振活体示踪骨髓单个核细胞并与心肌组织切片普鲁士蓝染色对照。结果:实验组7只和对照组1只小型家猪进入结果分析,两组各1只死于心肌梗死模型制备,实验组1只死于磁共振检查前麻醉意外。①骨髓单个核细胞的超顺磁氧化铁颗粒标记率近100%,在含Fe2O3-多聚左旋赖氨酸的培养基中骨髓单个核细胞可继续增殖,细胞形态无明显变化。②8只心肌梗死模型中,5只标记细胞移植后T2*WI序列心肌梗死周边见模糊的低信号区,4周后低回声信号均消失,离体T2*WI序列示梗死区周边一个呈点状分布的低信号区。③组织学检查发现5只(细胞数106以上)普鲁士蓝细胞阳性,分布部位与磁共振信号减低区一致。结论:超顺磁氧化铁颗粒标记骨髓单个核细胞安全、有效;T2*WI对磁标记骨髓单个核细胞的示踪最敏感;磁共振可对经冠脉途径植入的磁标记的干细胞进行活体示踪,磁共振信号改变与干细胞数目及分裂增殖状态相关。

摘要：背景:内皮祖细胞在骨髓中的含量高于外周血,但也仅占骨髓单个核细胞的1%。因此,在一般实验室培养过程中也需要解决提高内皮祖细胞体外扩增数量并保持其低分化状态的问题。目的:观察在含胎牛血清的M199培养基中加入血管内皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子诱导内皮祖细胞的定向分化能力。设计、时间及地点:以细胞为观察对象的开放性实验,于2007-09/2008-02在辽宁中医药大学教学实验中心bsl-2级实验室完成。材料:体质量(200±20)g的健康成年Wistar大鼠。方法:无菌采集健康Wistar大鼠股骨骨髓,应用Ficoll密度梯度离心的方法获得单个核细胞,加入含胎牛血清+肝素+血管内皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的M199实验培养液和不含诱导生长因子与肝素的M199培养液为对照组。主要观察指标:诱导骨髓细胞向内皮样细胞生长过程中,应用表面抗原免疫细胞化学染色鉴定细胞,以Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1双荧光实验鉴定培养细胞向内皮细胞分化的程度。结果:贴壁细胞培养诱导后具有内皮细胞的形态学特征,细胞呈上皮细胞样铺路石状贴壁生长,贴壁时间相对缓慢。加入M199实验培养液诱导后的第9天Ⅷ因子、CD31阳性表达的细胞分别为(55.1±7.2)%、(45.6±5.8)%,Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1双荧光染色阳性率为(78.2±5.4)%,提示为正在分化的内皮祖细胞。对照组相关抗原表达阴性,提示为分化早期的骨髓细胞。结论:结果显示骨髓单个核细胞培养出可稳定扩增的内皮祖细胞,在体外特殊诱导环境下定向分化为内皮样细胞,且效果优于对照组。

摘要：背景：如何解决尿道替代修复材料来源和改善新尿道的血液供应已成为尿道修复与重建研究的瓶颈问题。目的：观察血管内皮祖细胞对尿道缺损修复后改善新尿道组织血液循环的效果。设计、时间及地点：组织工程体内实验，于2006-01／2008-02在郑州大学第一附属医院外总实验室完成。材料：3～5月龄雄性日本大耳白兔13只，1只用于制备骨髓源单个核细胞，剩余12只随机分为细胞修复组8只，模型组4只。方法：无菌抽取兔两侧髂前上嵴骨髓，Percoll法贴壁分离培养单个核细胞，加入含VEGF、bFGF的培养基进行体外诱导分化，待细胞长满培养瓶底后胰蛋白酶消化传代。两组兔均建立尿道缺损模型，将脱细胞处理的无菌新鲜人羊膜修剪成1cm^2置于尿道缺损处，用0／6DG线将其两端分别与尿道残端连续缝合，形成尿道。细胞修复组将传至第3代的兔骨髓源单个核细胞浓度调整至10^10L^-1，注射于新尿道两端的吻合口处，每处0．1mL，0／6DG线间断缝合皮下组织覆盖成形后的尿道，并在近吻合口处和新修复尿道之中间处注射细胞悬液，每处0．5mL；模型组在同样位点注射等量的空白细胞培养液。移植后4，12周制作尿道组织石蜡切片。主要观察指标：细胞形态及鉴定结果，修复后尿道组织的血管再生情况。结果：兔骨髓源单个核细胞在体外呈贴壁生长，4d后生长加速，呈克隆样生长；第10天出现典型的铺路石样改变，并迅速表现出条索状、草束状生长形式；所培养的细胞表型由CD34^＋／CD133^＋／CD31^＋逐渐转变成CD34^＋／CD133^-／CD31^＋。与模型组比较，移植后第4，12周细胞修复组尿道组织内毛细血管再生数量均明显多于模型组（t=-9．034～5．985，P〈0．01）。结论：兔骨髓源单个核细胞可在体外诱导分化为血管内皮祖细胞，且血管内皮祖细胞对改善尿道缺损修复后局部血液循环的效果非常明显。

摘要：背景:细胞移植治疗心肌梗死为重建受损心肌带来希望,但移植后的细胞分化以及细胞移植能否长期持久地改善心脏功能等问题均不明确。目的:观察骨髓单个核细胞经冠状动脉移植入犬梗死心肌后,在心肌组织的分布、分化情况以及对心功能的影响。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-07/2008-03在泰达国际心血管病医院完成。材料:成年杂种犬16只,随机分为细胞移植组10只、模型对照组6只。方法:细胞移植组于髂前上嵴或髂后上棘穿刺抽取骨髓,经Ficoll密度梯度离心法分离获取骨髓单个核细胞,行CM-DiI标记。两组犬均结扎冠状动脉前降支建立急性心肌梗死模型,于心肌梗死后2h,细胞移植组向心肌梗死区注射骨髓单个核细胞悬液1mL(3×107～1×108个细胞),模型对照组注射等量生理盐水。主要观察指标:血流动力学指标及超声心动图指标的变化,免疫荧光染色观察骨髓单个核细胞在心脏的迁移、分布及分化结果:与模型对照组比较,细胞移植后6周细胞移植组血流动力学指标左室舒张末压显著降低(P<0.01),心排出量明显升高(P<0.05);超声心动图指标左室收缩末容积、左室舒张末容积均得到显著改善(P<0.01),射血分数、每搏输出量亦明显改善(P<0.05)。自体骨髓单个核细胞经冠状动脉移植后,可分布于心肌梗死区及梗死周边区,并表达肌球蛋白重链、连接蛋白43。结论:自体骨髓单个核细胞经冠状动脉移植后可分化为心肌样细胞,改善急性心肌梗死后的心功能。

摘要：背景:近年来干细胞移植在肾脏病领域取得了一定进展,但多局限于急性肾损伤,涉及慢性肾损伤方面的报道较少,且肾脏保护机制不清楚。目的:观察同种异体骨髓单个核细胞移植后慢性肾损伤大鼠尿蛋白排泄、肾功能的变化,以及对肾组织转化生长因子β1和结缔组织生长因子表达的影响。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2008-05/10在解放军沈阳军区总医院动物实验中心完成。材料:健康SPF级雌性SD大鼠30只,随机分为3组:正常对照组、模型组、细胞移植组,10只/组。另取雄性SD大鼠10只用于骨髓单个核细胞的制备。方法:模型组、细胞移植组大鼠采用改良肾脏5/6切除术建立慢性肾损伤模型,造模成功后10周,细胞移植组大鼠心脏内注射骨髓单个核细胞悬液1.0mL,细胞数1×108个/只,治疗4周;模型组心脏内注射等量生理盐水。主要观察指标:24h尿蛋白定量及肾功能变化,肾组织病理学变化,肾组织转化生长因子β1及结缔组织生长因子蛋白的表达。结果:①与正常对照组比较,模型组、细胞移植组大鼠尿蛋白排泄量及血清尿素、肌酐浓度均显著升高(P<0.01),但细胞移植组升高幅度明显低于模型组(P<0.01或P<0.05)。②苏木精-伊红染色及PAS染色后,与模型组比较,细胞移植组肾小球基质相对面积、肾小球硬化指数均明显减小(P<0.05)。③与正常对照组比较,模型组、细胞移植组转化生长因子β1及结缔组织生长因子的表达均显著增强(P<0.01),但细胞移植组增强幅度显著低于模型组(P<0.01)。结论:同种异体大鼠骨髓单个核细胞移植可以减少肾大部切除慢性肾损伤大鼠尿蛋白排泄,降低血清肌酐水平,抑制肾组织转化生长因子β1和结缔组织生长因子表达,减轻肾组织病理改变,起到肾脏保护用。

摘要：背景：内皮功能障碍与多种心血管疾病危险因素相关,主要体现为一氧化氮的生成减少或功能异常。自体骨髓干细胞移植进行心脏修复具有一定效果,但在治疗早期移植的干细胞对血管内皮细胞功能的影响尚不清楚。目的：探讨自体骨髓单个核细胞经冠状动脉移植后对心肌梗死并左心功能不全患者血管内皮功能的影响。设计、时间及地点：开放性临床实验,于2005-01/2006-12在北京大学第三医院心内科研究室完成。对象：北京大学第三医院同期收治的前壁心肌梗死并已成功再灌注治疗、置入冠状动脉内支架的男性患者16例,年龄33-75岁,按患者意愿分为细胞移植组8例,对照组8例。方法：两组患者均接受标准经皮冠状动脉支架置入和药物治疗,在此基础上,细胞移植组患者抽取自体骨髓液,密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞,经导管冠状动脉内注入细胞悬液（12.84±4.10）mL,细胞总数为（1.36±0.44）×10^9个,流式细胞仪测定CD34^＋细胞为（17.75±8.21）×10^6个。分别于细胞移植前后采集两组患者静脉血,制备血浆标本。主要观察指标：细胞移植前后血浆中一氧化氮、血管性血友病因子及前列环素2水平的变化。结果：与对照组比较,自体骨髓单个核细胞移植后24,72h细胞移植组血浆中一氧化氮浓度均明显升高（P=0.015,P=0.03）;血浆中血管性血友病因子、前列环素2水平差异无显著性意义（P〉0.05）。结论：经冠状动脉自体骨髓单个核细胞移植可在短期内提高血浆一氧化氮浓度,且不影响血浆血管性血友病因子及前列环素2水平,提示一定程度上可改善血管内皮舒张功能,且不损伤内皮功能。

摘要：背景:目前细胞移植治疗缺血性心脏病的大部分临床试验是针对急性心肌梗死患者梗死相关冠状动脉再通后骨髓单个核细胞的移植,结合外科手术同期予以细胞移植治疗陈旧性心肌梗死的报道相对较少。目的:探讨冠状动脉旁路移植术中骨髓单个核细胞经桥血管进行移植的可行性及安全性。设计:自身前后对照,病例分析。对象:2004-11/2005-06阜外心血管病医院收治的冠状动脉旁路移植手术患者10例,既往有陈旧性心肌梗死,需要进行冠状动脉旁路移植,术前左心室射血分数低于40%。方法:患者进行手术的同时,抽取自体骨髓血,采用Ficoll密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞。在桥血管远端吻合口完成后,将骨髓单个核细胞悬液10mL注射到前降支,其他桥血管经近心端将骨髓单个核细胞悬液10mL分别注射到回旋支和右冠状动脉内。主要观察指标:术后通过心脏超声、磁共振评价心功能。结果:10例患者术后均恢复顺利,术中采集骨髓血45～60mL,分离骨髓单个核细胞数量平均为4.1×107个,锥虫蓝排斥试验测定细胞活性>95%。心脏超声检查结果显示,与术前比较,术后1周及1,3个月患者左心室射血分数明显提高;术后心肌酶、肌钙蛋白T未见异常增高,心电图未发现围手术期心肌梗死改变。磁共振扫描结果显示,与术前比较,术后3个月左心室射血分数明显增加(P<0.01);左室舒张末期直径、左室收缩末期直径均明显缩小(P<0.05)。手术过程中及术后均未见与骨髓血采集以及细胞经冠状动脉桥血管内移植的相关并发症发生。结论:作为一种辅助性治疗手段,骨髓单个核细胞通过桥血管进行心肌内移植是安全可行的。

摘要：背景:骨髓单个核细胞为一组多潜能干细胞的混合体,在原发性扩张型心肌病领域的应用尚处于起步阶段。目的:评价经冠状动脉移植自体骨髓单个核细胞对阿霉素诱导的扩张型心肌病模型兔心肌间质重塑的影响。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2006-10/2007-06在复旦大学附属华山医院心血管研究室完成。材料:普通级3月龄雄性新西兰兔30只,由上海中医药大学实验动物中心提供。阿霉素为深圳万乐药业股份有限公司产品,批号0602E1。方法:30只兔均经耳缘静脉注射盐酸阿霉素建立扩张型心肌病模型,造模后存活兔取10只用于模型观察,剩余20只随机分为移植组、对照组,10只/组。移植组兔抽取髂骨骨髓,采用密度梯度离心法分离自体骨髓单个核细胞,于造模2周后经塑性的4F造影导管模拟临床冠状动脉内输注骨髓单个核细胞悬液2mL。对照组兔同样接受骨髓液采集以平衡手术操作创伤对实验结果的影响,完成选择性左冠状动脉造影后,经造影导管注射2mL生理盐水。主要观察指标:通过RT-PCR半定量检测心肌胶原容积分数、基质金属蛋白酶1,3mRNA的表达评价心肌间质重塑,通过血流动力学指标和血清脑钠素浓度评价心功能的变化。结果:移植组脱落2只,对照组脱落1只。细胞移植4周后与对照组比较,移植组胶原纤维增生进程延缓,心肌胶原容积分数显著降低(P<0.01),基质金属蛋白酶1,3mRNA的表达呈下降趋势(t=4.45,P<0.01),左心室收缩压、压力变化速率最大值均显著升高,左心室舒张末压显著下降(t=9.12,P<0.01),血清脑钠素浓度明显降低(t=6.05,P<0.05)。结论:经冠状动脉移植自体骨髓单个核细胞,可能通过抑制基质金属蛋白酶的应激性改变而延缓心肌间质重塑中胶原代谢进程,有助于改善扩张型心肌病模型兔的心功能。

摘要：背景:骨髓干细胞能够修复受损心肌,改善不利的心室重构及恶化的心功能,但细胞移植后对梗死心室重构影响的分子机制仍不清楚。目的:观察骨髓单个核细胞心肌移植后,心肌组织NF-κB、基质金属蛋白酶及其抑制因子表达的变化。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-07/2007-05在解放军总医院心血管外科实验动物中心和解放军军事医学科学院病原微生物生物安全国家重点实验室完成。材料:成年健康雄性杂种犬24只,随机分为急性心肌梗死对照组、急性心肌梗死移植组、陈旧心肌梗死对照组、陈旧心肌梗死移植组,6只/组。方法:急性心肌梗死对照组、急性心肌梗死移植组在冠状动脉左前降支主干结扎1h,观察缺血梗死区仍然呈暗红色,确认急性心肌梗死模型建立成功。陈旧心肌梗死对照组、陈旧心肌梗死移植组在移植前行超声心动图检查,证实左室前壁和心尖部可见节段性室壁运动异常,确认陈旧心肌梗死模型建立成功。Ficoll分离法获得犬自体骨髓单个核细胞悬液,急性心肌梗死移植组在造模后1h于梗死区及梗死边缘区分多点注射细胞悬液,每点注射0.5mL,(1～2)×107个细胞/mL;陈旧心肌梗死移植组于造模后4周开胸确认梗死区,同法行细胞移植。主要观察指标:RT-PCR法检测心肌组织基质金属蛋白酶及其抑制因子mRNA的表达,Western免疫印迹法检测心肌组织NF-κB的表达。结果:移植后6周与相应对照组比较,急性心肌梗死移植组、陈旧心肌梗死移植组的梗死区、梗死周围区基质金属蛋白酶2,9mRNA及NF-κB表达均显著降低(P<0.01),基质金属蛋白酶抑制因子1,2mRNA表达均显著升高(P<0.01)。结论:犬自体骨髓单个核细胞心肌移植可能通过抑制NF-κB活化,导致基质金属蛋白酶mRNA表达减少及其抑制因子mRNA表达增加,从而抑制梗死后心室重构过程。

摘要：背景:细胞凋亡增加所导致的进行性心肌细胞丢失是引起急性心肌梗死后充血性心力衰竭的主要原因之一,通过降低肿瘤坏死因子α浓度及Bax蛋白、PDCD5mRNA表达可以抑制急性心肌梗死后心肌细胞凋亡。目的:探讨同种异体骨髓单个核细胞移植对急性心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡及相关基因表达的影响。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-01/11在华中科技大学附属协和医院完成。材料:体质量为(240±20)g的Wistar大鼠60只,随机分为假手术组、模型对照组、细胞移植组,20只/组。另取体质量为100～150g的Wistar大鼠60只用于制备骨髓单个核细胞。方法:模型对照组、细胞移植组大鼠结扎冠状动脉左前降支,建立急性心肌梗死模型;假手术组大鼠仅开胸,不结扎冠状动脉左前降支。造模后,细胞移植组大鼠在梗死心肌周围分4点于心外膜下植入骨髓单个核细胞悬液,每点100μL(107个细胞);假手术组、模型对照组同法注射等量DMEM培养基,培养4周。主要观察指标:血清及非梗死区心肌组织中肿瘤坏死因子α的水平,左室非梗死区心肌细胞凋亡指数、Bax蛋白和PDCD5mRNA的表达。结果:移植后4周,细胞移植组在发生凝固坏死的宿主心肌内可以看到局灶BrdU标记阳性的骨髓单个核细胞。与假手术组比较,移植后4周模型对照组、细胞移植组血清和心肌组织中肿瘤坏死因子α水平均显著升高(P<0.05),但细胞移植组升高幅度明显小于模型对照组(P<0.05)。与假手术组比较,模型对照组和细胞移植组左心室非梗死区心肌细胞凋亡指数、Bax蛋白和PDCD5mRNA(PDCD5/GAPDH)均明显升高(P<0.05),但细胞移植组升高幅度明显小于模型对照组(P<0.05)。结论:同种异体骨髓单个核细胞移植可以抑制大鼠心肌梗死后心肌细胞凋亡的发生,其机制可能与其抑制肿瘤坏死因子α的表达、降低Bax蛋白和PDCD5基因的促凋亡作用有关。