摘要：背景：骨组织工程支架材料中PDPB是一种较为理想的骨移植材料，目前多采用体外培养的骨髓基质干细胞与支架材料构建组织工程骨后修复骨缺损。目的：实验拟验证骨髓基质干细胞与PDPB体外构建组织工程骨的最佳浓度及移植入体内的最佳时机。设计．时间及地点：随机分组设计，对照观察，于2007—10／12在中国科学院动物研究所完成。材料：2周龄日本大耳兔，体质量2．0kg左右，用于培养骨髓基质干细胞。取新鲜的猪椎骨制备PDPB。方法：传代培养骨髓基质干细胞，矿化液对兔骨髓基质干细胞进行分化鉴定后，取不同浓度（1×10^10L^-1、5×10^9L^-1、1×10^9L^-1、5×10^8L^-1）的兔骨髓基质干细胞与PDPB复合体外构建组织工程骨。主要观察指标：倒置显微镜下观察细胞的生长形态：扫描电镜观察骨髓基质干细胞在PDPB上的黏附情况：四甲基偶氮唑盐法检测各浓度骨髓基质干细胞在PDPB上的生长情况。结果：①原代培养24h部分细胞开始贴壁，6d后贴壁生长的细胞数量增多，10--12d集落逐渐增大，并融合为单层。经矿化液诱导培养21d后，行矿化沉积茜素红染色及碱性磷酸酶细胞化学染色，可见大量细胞呈碱性磷酸酶阳性及大量钙结节形成。②扫描电镜观察骨髓基质干细胞在PDPB上黏附良好，第8天时细胞和材料结合紧密。第10天细胞呈梭形生长，部分细胞突起翘起。③各浓度组骨髓基质干细胞在PDPB上的生长曲线形态基本相同，呈“S”形。2-6d细胞开始在支架材料上大量增殖，第6天后细胞活力逐渐降低，其中5×10^9L^-1浓度骨髓基质干细胞复合PDPB后细胞可以很好的黏附，细胞活性好。结论：骨髓基质干细胞和PDPB复合的最佳浓度是5×10^9L^-1，移植的最佳时机为6d。

摘要：背景:一系列研究发现,骨髓基质干细胞可在体外经人工诱导分化为神经元样细胞,有望用以移植治疗神经退行性疾病,但是其分化的分子机制尚不明了。目的:观察骨髓基质干细胞向神经元样细胞分化前后基因表达谱的变化。设计、时间及地点:观察性实验,于2006-12/2007-12在苏州大学附属第二医院神经外科脑肿瘤研究室完成。材料:健康成年近交系Wistar大鼠,体质量约300g。方法:体外培养和纯化大鼠骨髓基质干细胞,用碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子对其进行诱导,分别于诱导前和诱导后第7天抽提RNA后利用Affymetrix基因芯片检测分析诱导前后差异基因表达谱,并有选择地对其中的一些重要基因进行实时定量PCR验证。主要观察指标:①骨髓基质干细胞的培养及诱导分化。②诱导分化后神经细胞的鉴定。③诱导分化前后基因芯片的检测。④基因芯片结果的分析。⑤实时定量PCR的验证。结果:骨髓基质干细胞经诱导后形态上呈神经元样细胞改变,免疫荧光证实β-TubulinⅢ染色后阳性率为(69.04±5.63)%。基因芯片共发现差异基因215条,其中上调基因125条,下调基因90条。明确与神经元发育密切相关的基因有13条,其中上调7条,下调6条。挑选重要的4条基因Bmp4、Robo2、Numb、Enc1进行实时定量PCR验证,其结果与基因芯片结果相符。结论:骨髓基质干细胞在体外诱导分化为神经元样细胞的相关基因表达谱中,有一些明确与神经元分化密切相关的基因存在差异表达,深入研究这些基因可能为基因工程改造骨髓基质干细胞奠定基础。

摘要：背景：近年来的研究发现,结合组织工程技术利用经诱导转化的骨髓基质干细胞能成功地在动物体内再生出骨组织,并在大型哺乳动物负重骨缺损的修复实验中取得了较好的修复效果。目的：观察富血小板血浆诱导培养人骨髓基质干细胞在体内的成骨特性,探讨采用富血小板血浆诱导培养的人骨髓基质干细胞与珊瑚羟基磷灰石材料体内异位成骨的可行性。设计、时间及地点：配对样本观察,于2007-10/2008-04在中山大学组织工程实验室完成。材料：4周龄BALB/C裸鼠14只,体质量22-24g,麻醉后将裸鼠两侧股部切开,于股部肌间隙内制成肌袋模型。方法：14只裸鼠左侧肌袋内植入珊瑚羟基磷灰石复合富血小板血诱导培养的人骨髓基质干细胞,作为实验组;右侧背部肌袋内植入单纯珊瑚羟基磷灰石材料为对照组。主要观察指标：分别于植入后4,8,12周对比观察两组裸鼠活动及进食情况;X射线平片观察阻射率;苏木精-伊红染色观察骨形成情况。结果：14只裸鼠均进入结果分析。①植入材料后裸鼠活动及进食均正常,伤口愈合良好。材料随植入时间的延长无明显吸收,而材料周围的肌肉组织等软组织由外向内逐渐长入材料孔隙内有所增多。②随时间延长两组X射线平片阻射影像密度逐步增加。植入材料后4,8,12周实验组与对照组相比,差异有非常显著性意义（P〈0.01）。③植入材料后4周,实验组可见珊瑚羟基磷灰石表面有细胞生长,孔隙内有结缔组织长入;对照组仅见珊瑚羟基磷灰石表面有细胞生长。8周时珊瑚羟基磷灰石表面有新生骨形成,孔隙内和孔隙边缘可见骨样组织沉积和少量软骨样组织形成;对照组仅见少量纤维结缔组织长入。12周时珊瑚羟基磷灰石材料表面有较多成熟编织骨形成,部分区域可见髓腔样结构形成,并有血管长入;对照组仍未见新骨及骨样组织形成。结论：富血小板血浆诱导培养人骨髓基质干细胞与珊瑚羟基磷灰石材料在裸鼠体内能够良好的成骨,随时间的延长,成骨特性越明显;体内采用肌袋包裹的方法能有效增加血运及促进组织工程骨血管化生成,促进成骨。

摘要：背景:骨髓基质干细胞具有向神经组织细胞分化的多潜能特性。以往实验以化学试剂作为诱导剂加入细胞培养液中,在体外成功地诱导出神经组织细胞。目的:观察大鼠施万细胞和骨髓基质干细胞体外共培养后,骨髓基质干细胞能否被诱导向神经组织细胞分化。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2006-09/2008-10在南通大学医学院组织学与胚胎学教研室及江苏省神经再生重点实验室完成。材料:SPF级新生1～3d龄SD大鼠用于制备施万细胞,SPF级成年雄性SD大鼠用于制备骨髓基质干细胞,动物均由南通大学实验动物中心提供。方法:将传2代培养的骨髓基质干细胞和施万细胞分别以1×105和1×106的密度接种于transwell双层6孔细胞培养板的皿底和板底,两种细胞间隔以PET膜,其膜孔径为0.4μm,于37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中进行非接触性共培养14d。另外,将施万细胞培养上清作为条件培养基,培养骨髓基质干细胞14d。主要观察指标:光镜下观察共培养后骨髓基质干细胞的形态变化;MTT检测共培养前后骨髓基质干细胞的活性;免疫荧光染色鉴定共培养后骨髓基质干细胞S-100蛋白的表达,流式细胞仪测定S-100蛋白阳性率;免疫荧光染色检测条件培养基培养后骨髓基质干细胞S-100,P75,GFAP的表达。结果:共培养后的骨髓基质干细胞形态发生改变,原来宽大扁平的胞体开始收缩,细胞胞体呈梭形,部分细胞类似施万细胞呈线性排列。共培养前后及条件培养基培养后,骨髓基质干细胞的活力无明显差异(P>0.05)。共培养14d后,骨髓基质干细胞表达施万细胞表面标记S-100蛋白,阳性率达(22.54±2.36)%。条件培养基培养14d后,骨髓基质干细胞表达施万细胞表面标记S-100蛋白,P75,GFAP。结论:施万细胞分泌因子可以诱导部分骨髓基质干细胞向神经组织细胞分化,并表达施万细胞表面标记。

摘要：背景:在细胞获取、培养、移植等体外环境体系下,骨髓基质干细胞能否有效的应用于局部基因治疗尚不清楚。目的:课题创新性提出构建外源性hBMP-7基因真核表达载体,并期望可提高被转染的兔骨髓基质干细胞诱导成骨能力。设计、时间及地点:细胞-基因学体外观察,于2006-07/2007-07在哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心完成。材料:人健康新鲜胎盘组织由哈尔滨医科大学附属二院妇产科提供,产妇知情同意。健康雄性新西兰大耳白兔1只,由哈尔滨医科大学动物中心提供。方法:从人胎盘组织中克隆出hBMP-7基因,与真核表达载体pcDNA3.1连接,构建重组pcDNA3.1-hBMP-7真核表达载体。从兔骨髓中分离培养骨髓基质干细胞,分为3组:pcDNA3.1-hBMP-7转染组、空载体pcDNA3.1转染组、未转染组。转染前1d取第2代骨髓基质干细胞5×106个,接种到60mm3含无抗生素培养基的培养皿中进行转染。主要观察指标:使用RT-PCR、免疫组织化学等方法检测hBMP-7在骨髓基质干细胞中的表达,检测各组细胞碱性磷酸酶、胶原、骨钙蛋白的合成情况。结果:转染72h后,pcDNA3.1-hBMP-7转染组于1.3kb处出现特异性条带,细胞胞浆有棕色的颗粒出现,另2组均呈阴性。pcDNA3.1-hBMP-7转染组骨髓基质干细胞碱性磷酸酶活性于转染后第2天显著增高,第8天达峰值,各时间点pcDNA3.1-hBMP-7转染组骨髓基质干细胞碱性磷酸酶活性、羟脯氨酸合成量、骨钙蛋白含量均明显高于其他2组(P<0.05或0.01)。结论:实验成功构建了pcDNA3.1-hBMP-7真核表达载体。结局证明了外源性hBMP-7基因可在兔骨髓基质干细胞中充分、高效表达,并且这种外源性hBMP-7基因具备促进兔骨髓基质干细胞向成骨细胞转化的能力。

摘要：背景:研究证明细胞的密度、细胞之间的相互作用、培养的体系、细胞因子等对骨髓基质干细胞的分化产生影响。目的:实验拟验证微球培养的人骨髓基质干细胞在特定诱导条件下向软骨细胞的分化情况。设计、时间及地点:以细胞为对象的观察实验,于2006-02/2007-10在青岛市城阳人民医院干细胞实验室完成。材料:骨髓标本取自股骨颈骨折或者髋关节炎症实施髋关节置换手术患者。方法:抽取人骨髓组织,采用密度梯度法分离培养骨髓基质干细胞。当培养的骨髓基质干细胞达到7×106个细胞时,将每500000个细胞离心制成高密度细胞微球,在含有DMEM高糖、胰岛素、转铁蛋白、选择素、丙酮酸、脯氨酸、BSA、地塞米松、抗坏血酸的促软骨细胞分化培养液培养6周。主要观察指标:分析细胞外基质中蛋白聚糖含量,并通过组织化学和免疫组织化学方法,以阿尔新蓝染色细胞外基质中的蛋白聚糖,以胶原蛋白II染色显现细胞外基质中的胶原蛋白II,对成软骨方向分化的质量进行评价。结果:在微球培养的第3周就可以检测到细胞外基质中的蛋白聚糖,并且随着时间的增长其单位细胞的蛋白聚糖分泌量不断增加。通过阿尔新蓝和胶原蛋白II染色,镜下观察在培养的第4周,细胞微球就可以形成细胞外特异性的软骨基质、蛋白多糖和II型胶原;6周时,细胞外基质中蛋白聚糖和胶原蛋白II形成更加明显。结论:在无血清软骨细胞分化培养液中,采用高密度微球培养方法可定向诱导骨髓基质干细胞分化为软骨细胞。

摘要：背景:许旺细胞是周围神经系统中惟一的神经胶质细胞,在周围神经再生中有重要的作用,但其存在增殖能力差,需要异体取材,体外培养困难和活性下降等缺点。目的:分析利用人骨髓基质干细胞经诱导分化为许旺细胞构建组织工程化神经修复神经缺损的可能性。设计、时间及地点:随机分组设计、动物对照观察,2004-03/2005-04在黑龙江省兽医药研究所完成。材料:8周龄雌性Wistar大鼠24只。建立10mm坐骨神经缺损的动物模型。方法:24只大鼠按随机数字表法分为3组,组织工程化神经移植组、单纯聚乳酸导管移植组、自体神经移植组,每组8只。组织工程化神经移植组:经诱导骨髓基质干细胞分化许旺细胞与天然细胞外基质凝胶及可降解聚乳酸导管构建组织工程化神经桥接神经缺损;单纯聚乳酸导管移植组:单纯将细胞外基质凝胶注入可降解聚乳酸导管桥接神经缺损;自体神经移植组:将截取的10mm神经旋转180°后,行断端吻合。主要观察指标:移植后12周进行神经电生理、新生神经组织学观察和轴突计数等检测坐骨神经功能恢复情况。结果:诱导后成人骨髓基质干细胞具有许旺细胞形态及特性。移植后12周,再生神经已通过缺损区长至远端。组织工程化神经移植组、自体神经移植组各项检测指标均优于单纯聚乳酸导管移植组(P0.05);组织工程化神经移植组、自体神经移植组聚乳酸导管降解吸收明显。结论:人骨髓基质干细胞在体外可诱导分化为许旺细胞,利用其与细胞外基质及可降解聚乳酸导管构建组织工程化神经可修复周围神经缺损。

摘要：背景:骨髓基质干细胞来源的成骨细胞是骨髓腔内主要的受力细胞,在人工关节置换病例中,其生命活动状况与假体传导压力有密切关系。目的:观察持续性压力培养环境对兔骨髓基质干细胞增殖的影响,揭示持续压力致假体松动下沉进展及其置换后活动影响的生物学机制。设计、时间及地点:随机分组设计,细胞学体外观察,于2004-02/2007-10在解放军第四军医大学骨科研究所完成。材料:出生1个月的新西兰幼兔1只,体质量0.5kg,取其骨髓基质干细胞用于实验。方法:传代培养兔骨髓基质干细胞,将生长良好的第3代骨髓基质干细胞按1×104个/孔随机接种于7块24孔培养板,14h后细胞完全贴壁,换新鲜含体积分数为10%胎牛血清的DMEM。实验随机将4块培养板分为4组:对照组不予加压,20kPa持续压力组,60kPa持续压力组,100kPa持续压力组分别在规定的时间内每天施以20,60,100kPa的持续3h压力。主要观察指标:四甲基偶氮唑盐法检测培养1,3,5,7d各组骨髓基质干细胞的吸光度值变化。结果:除培养第1天外,第3,5,7天各压力组骨髓基质干细胞的吸光度值均低于对照组(P0.05),但均高于100kPa持续压力组(P<0.05)。第5天不同持续压力组吸光度值两两比较差异具有显著性意义(P<0.05),压力越高,吸光度值越低。第7天100kPa持续压力组吸光度值低于压力20kPa持续压力组(P<0.05)。结论:关节置换后早期患者不宜过早下地,否则将产生持续性应力,可以引起骨髓腔内骨髓基质干细胞的抑止,从而不利于骨质愈合,容易产生假体下沉和松动。

摘要：背景：目前修复软骨缺损的方法都存在修复组织数量不足，生物力学性能不佳，整合不良及供区并发症等缺陷。对于大面积的骨软骨复合缺损单独应用一种方法尚显不足。目的：观察组织工程方法复合Mosaicplasty技术用于修复大面积骨软骨缺损的效果。设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2009—0I／09在青岛大学医学院中心实验室完成。材料：体外培养并扩增健康成年雄性山羊的骨髓基质干细胞，收集约3×10^7细胞，加入1mL藻酸钠溶液重恩形成骨髓丛质干细胞-藻酸钙凝胶材料。方法：12只山羊用于制备膝关节股骨髁大面积骨软骨缺损模型，骨髓基质干细胞Mosaicplasty组使用自制Mosaicplasty器械，植入直径2mm骨软骨柱镶嵌充填缺损，以自体骨髓基质干细胞复合藻酸钙凝胶填充残余缺损和部分供区。Mosaicplasty组单纯用Mosaicplasty修复骨软骨缺损。对照组单纯制造缺损不修复。主要观察指标：①大体观察：术后4，8，16周分别切开关节观察修复效果。②组织学检查：术后16周取修复组织标本，行苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色光镜下观察。③电镜观察：取16局修复组织行透射电镜检查。结果：术后16周时骨髓基质干细胞-Mosaicplasty组移植物固定牢固，关节面平滑，移植物间界限消失，新生软骨组织类似于正常软骨，4-16周修复效果逐渐改善，优于其他各组。光镜观察细胞-凝胶新生软骨组织与移植软骨结合紧密，新生软骨细胞排列规整，细胞外基质分布均。对照组无明显修复。透剔电镜观察发现修复新生组织中细胞形态类似软骨细胞，细胞存在于排列紧密的纤维网格中，基质丰富。结论：使用自体骨髓基质干细胞-藻酸钙凝胶材料复合Mosaicplasty技术可促进骨软骨整合．改善其修复效果。

摘要：目的:采用均匀设计法筛选及验证小鼠骨髓基质干细胞体外转化为肝细胞的最佳诱导培养体系.方法:获取小鼠骨髓基质干细胞,根据均匀设计法分8组进行体外诱导实验.通过流式细胞术检测各组ALB及CK18的阳性表达率,通过逐步回归分析法确立最佳细胞因子组合及浓度.从基因水平、蛋白水平以及细胞合成代谢功能检测,证实诱导的细胞为有功能的肝细胞.结果:FGF取35μg/L,OSM取30μg/L时,ALB及CK18的阳性细胞达到最高值.采用该最佳诱导体系诱导过程中可检测到细胞表达ALB mRNA、CK18 mRNA、AFP mRNA、TTR mRNA;以及ALB、CK18蛋白表达;第21天最佳体系诱导组ALB阳性细胞的比例为82.83%±9.03%,CK18阳性细胞的比例为74.79%±8.41%.诱导培养过程中细胞分泌尿素及白蛋白,且随诱导时间的延长而增强.结论:均匀设计法可有效进行最佳诱导体系的筛选,以35μg/L FGF、30μg/L OSM为主的诱导培养体系,可以有效地促进骨髓基质干细胞体外定向转化为有功能的肝细胞.