摘要：背景:通过对鹿角片煅制品促进骨髓间充质干细胞增殖效果的科学探究,为传统中医药与现代再生医学的融合创新提供实证支持,推进传统中药在骨骼系统疾病治疗领域的广泛应用。目的:探讨鹿角片煅制品对骨髓间充质干细胞增殖的影响。方法:通过不同材料(如陶泥、黄泥、盐黄泥)的包裹,对鹿角片进行煅制处理,共设计7种不同的煅制样品(陶泥-棉布、黄泥-棉布、盐黄泥-棉布、黄泥-锡箔纸、盐黄泥-锡箔纸、黄泥-蜜炙、盐黄泥-蜜炙煅制的鹿角片),测定煅制前后鹿角片水溶性浸出物含量。采用CCK-8实验评估不同鹿角片煅制品水提物对骨髓间充质干细胞增殖活性的影响。结果与结论:①煅制方法显著提高了鹿角片的水溶性浸出物含量,其中黄泥-蜜炙煅制鹿角片的水溶性浸出物含量最高;②鹿角片煅制品能够显著促进骨髓间充质干细胞的增殖,其中黄泥-蜜炙煅制鹿角片对骨髓间充质干细胞增殖的促进效果最为显著。

摘要：目的:探讨骨髓间充质干细胞(BMSC)移植对肾损伤大鼠体内细胞焦亡的影响及其机制。方法:体外分离培养4~5周龄清洁级雌性SD大鼠的BMSC,取第3代细胞用于后续实验。采用成组设计,随机将15只6周龄清洁级雌性SD大鼠分为对照组、肾损伤模型组和BMSC组,每组5只。采用经尾静脉注射脂多糖(LPS)1 mg/kg构建肾损伤模型;对照组以相同途径给予等量生理盐水。BMSC组于制模后2 h经尾静脉注射BMSC 0.5 mL(含BMSC 2×10^(6)个);肾损伤模型组和对照组给予等量生理盐水。于术后3 d取各组大鼠腹主动脉血,采用苦味酸法检测血肌酐(SCr)水平,采用二乙酰一肟法检测血尿素氮(BUN)水平,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血胱抑素C(Cys C)和白细胞介素(IL-1β、IL-18)水平。处死大鼠取肾组织,采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测大鼠肾组织NOD样受体蛋白3(NLRP3)、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶1(caspase-1)的mRNA表达;采用蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)检测大鼠肾组织NLRP3、caspase-1的蛋白表达。结果:体外培养显示,骨髓细胞悬液培养24 h后出现大量圆形贴壁细胞和悬浮细胞,培养4~5 d后有大量长梭形细胞聚集性贴壁生长,仍可见明显的杂质细胞,经胰酶消化并传代至第3代以长梭形贴壁细胞为主,基本纯化为BMSC。体内实验显示,与对照组比较,肾损伤模型组大鼠SCr、BUN、Cys C、IL-1β、IL-18水平均明显升高〔SCr(μmol/L):85.22±2.29比21.80±0.59,BUN(mmol/L):11.50±0.64比5.86±0.83,Cys C(mg/L):0.13±0.01比0.11±0.02,IL-1β(ng/L):31.49±1.42比4.74±0.49,IL-18(ng/L):29.01±1.95比1.52±0.03,均P<0.05〕,NLRP3及caspase-1的mRNA和蛋白表达水平也均明显升高〔NLRP3 mRNA(2-ΔΔCt):3.635±0.296比1.000±0.002,caspase-1 mRNA(2-ΔΔCt):4.020±0.228比1.001±0.003;NLRP3蛋白(NLRP3/β-actin):1.560±0.868比0.902±0.036,caspase-1蛋白(caspase-1/β-actin):1.392±0.097比0.895±0.046,均P<0.05〕。与肾损伤模型组比较,BMSC组大鼠SCr、BUN、IL-1β、IL-18水平均明显下降〔SCr(μmol/L):51.64±3.84比85.22±2.29,BUN(mmol/L):9.90±0.46比11.50±0.64,IL-1β(ng/L):24.20±1.45比31.49±1.42,IL-18(ng/L):12.97±1.25比29.01±1.95,均P<0.05〕,NLRP3及caspase-1的mRNA和蛋白表达水平也均明显下降〔NLRP3 mRNA(2-ΔΔCt):1.488±0.136比3.635±0.296,caspase-1 mRNA(2-ΔΔCt):1.643±0.143比4.020±0.228;NLRP3蛋白(NLRP3/β-actin):1.227±0.053比1.560±0.868,caspase-1蛋白(caspase-1/β-actin):1.159±0.107比1.392±0.097,均P<0.05〕。结论:在体内,BMSC可以减轻LPS所致肾损伤大鼠的细胞焦亡。

摘要：背景:一些研究发现电刺激可以改变成熟心肌细胞的分布和电生理特性,其是否对骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的过程产生影响目前还不清楚。目的:在诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化过程中,观察低压脉动电刺激对肌细胞增强因子2C基因表达的影响。设计、时间及地点:对比观察电刺激细胞学体外实验,于2005-09/2007-03在四川大学老年病研究室完成。材料:清洁级4周龄雄性SD大鼠5只,由四川大学华西医学中心动物实验室中心提供。诱导剂5-氮胞苷为Sigma产品。使用一次性100mL培养瓶、镍钛合金金属丝、心脏起搏器和连接导线设计制作电场。方法:密度梯度离心+贴壁法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,传至第3代按1×107L-1接种到电场内,细胞爬满80%后,加入终浓度为10μmol/L5-氮胞苷进行诱导。分别于诱导第1,2,3,4周收集细胞,分为2组:刺激组施加电场刺激,刺激参数选择1.5V/cm电压,2ms方波,频率1Hz,刺激2周;对照组单纯以5-氮胞苷诱导。主要观察指标:免疫细胞化学法和westernblot技术检测肌钙蛋白I表达,RT-PCR法分析肌细胞增强因子2C基因的表达。结果:诱导后细胞停止生长,并倾向集落化,诱导第2周两组均开始出现肌钙蛋白I阳性细胞,第3、4周明显增强,诱导各时间点刺激组肌钙蛋白I表达量均显著高于对照组(P<0.05)。诱导第1周两组均开始表达肌细胞增强因子2C基因,第2周明显增强,第3周达高峰,持续到第4周,诱导各时间点刺激组肌细胞增强因子2C基因的表达量均显著高于对照组(P<0.05)。结论:肌细胞增强因子2C基因可能参与调控心肌细胞的形成过程,而电场刺激通过上调肌细胞增强因子2C基因的表达,进而促进肌钙蛋白I的表达和心肌细胞的形成。

摘要：背景:课题组前期研究表明移植骨髓间充质干细胞能减轻哮喘气道炎症程度且能调节哮喘炎症因子水平,进一步体外研究提示骨髓间充质干细胞分泌的半乳凝素1能影响树突状细胞的免疫功能,而骨髓间充质干细胞分泌的半乳凝素1对哮喘的作用尚不明确。目的:观察骨髓间充质干细胞分泌的半乳凝素1对哮喘小鼠气道炎症的影响。方法:构建小鼠pLVX-gal-1-shRNA并感染骨髓间充质干细胞。取40只雌性BALB/c小鼠,随机分为正常对照组、哮喘模型组、骨髓间充质干细胞组、重组半乳凝素1蛋白组、干扰半乳凝素1表达的骨髓间充质干细胞组,对比各组小鼠肺泡灌洗液中炎症细胞总数及分类的差异,采用苏木精-伊红染色观察各组小鼠气道炎症变化。结果与结论:(1)针对小鼠半乳凝素1基因设计了4条RNA干扰序列,通过Real-timePCR验证249干扰位点的干扰序列对半乳凝素1基因干扰效果最佳,并以此进行后续的体内实验;(2)与正常对照组相比,哮喘模型组肺泡和气道周围有大量的炎症细胞聚集,以嗜酸性粒细胞为主;骨髓间充质干细胞组或重组半乳凝素1蛋白组气道及肺泡灌洗液中炎症细胞显著减少,而半乳凝素1基因干扰的骨髓间充质干细胞输注对哮喘小鼠气道及肺泡灌洗液炎症细胞聚集无明显影响;(3)结果表明骨髓间充质干细胞分泌的半乳凝素1对哮喘小鼠气道炎症有明显的抑制作用。

摘要：骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,b MSCs)具有自我更新、支持造血、多向分化和低免疫原性等特点,在调控树突状细胞(dendritic cells,DCs)成熟的过程中发挥重要作用。为了探讨b MSCs调控DCs成熟的机制,本研究通过分离培养正常捐献者b MSCs,并分离获取外周静脉血单个核细胞,诱导未成熟的树突状细胞(immature dendritic cells,im DCs)和成熟的树突状细胞(mature dendritic cells,m DCs)生成。根据Genebank中人STAT3全长基因序列,设计针对STAT3的siRNA。根据培养条件不同设计实验分组:正常b MSCs与im DCs共培养(阴性对照组),转染siRNA的b MSCs与im DCs共培养(siRNA组)、加入JAK/STAT通路抑制剂AG490的b MSCs与im DCs共培养(AG490组)、加入TNF-α诱导的m DCs(阳性对照组)共4组,共培养72 h,流式细胞术分析DCs表型变化,ELISA检测培养液上清中IL-12水平变化。结果显示,阴性对照组不表达CD40、CD80、CD83、CD86和HLA-DR标志树突细胞成熟的分子,而表达CD11 b,其表型与im DCs一致;而siRNA组和AG490组的DCs表达CD40、CD80、CD83、CD86和HLA-DR等标志分子,而不表达CD11 b,其表型与TNF-α诱导成熟的m DCs表型一致;siRNA组、AG490组和阳性对照组的IL-12水平较阴性对照组的IL-12水平显著升高(P0.05)。以上结果表明,通过siRNA和抑制剂AG490阻断b MSCs中JAK/STAT3通路促进了im DCs的成熟,提示b MSCs通过JAK/STAT3通路参与调控im DCs成熟。

摘要：背景:目前尚缺乏骨髓间充质干细胞及其诱导分化后成骨细胞超微结构特点的观察。目的:采用全骨髓培养-贴壁筛选法分离培养骨髓间充质干细胞,诱导其向成骨细胞方向分化,利用光镜和电镜观察诱导和未诱导分化细胞的细微和超微结构特点。设计、时间及地点:观察实验,于2007-03/2008-04在河北医科大学人体解剖教研室和白求恩国际和平医院骨科完成。材料:成年新西兰大白兔由白求恩国际和平医院实验动物中心提供。HitachiS-3500N型扫描电镜和Hitachi-7500型透射电镜。方法:从新西兰大白兔髂后上嵴处抽取骨髓。经原代及传代培养后,取部分第3代细胞加入诱导剂,诱导剂为10mmol/Lβ-甘油磷酸钠,10-8mmol/L地塞米松,50mg/L维生素C。培养2周后,诱导和未加诱导的骨髓间充质干细胞进行碱性磷酸酶、骨形态发生蛋白和钙化结节检测。主要观察指标:光镜观察骨髓间充质干细胞及其诱导分化后成骨细胞的一般形态学特征;电镜观察骨髓间充质干细胞和成骨细胞的超微结构特点。结果:培养的第3代骨髓间充质干细胞,其碱性磷酸酶染色呈强阳性反应;钙化结节染色和骨形态发生蛋白免疫组织化学检测,均呈现阴性结果。经向成骨细胞诱导分化后,其碱性磷酸酶染色,钙化结节染色和骨形态发生蛋白免疫组织化学检测,均呈现阳性反应。光镜和扫描电镜观察显示,骨髓间充质干细胞大部分呈长梭形,少量呈星形;经向成骨细胞诱导分化后,细胞体积增大,更加饱满,似鱼群样排列。透射电镜观察显示,骨髓间充质干细胞的细胞器较丰富,向成骨细胞诱导分化后,其线粒体明显增多,出现较多的基质小泡、髓样体和空泡状结构。结论:骨髓间充质干细胞成骨诱导分化后细胞的超微结构表现为胞浆中出现增多的基质小泡、髓样体和空泡状结构。

摘要：背景:骨髓间充质干细胞在适宜的培养条件下可被诱导分化成各种组织细胞,此外还具有基质细胞的特性,能够分泌各种细胞因子,支持造血功能,是组织重塑和功能修复的理想细胞来源。目的:对影响骨髓间充质干细胞成骨过程的各种因素和涉及的常见信号转导通路进综述。方法:应用计算机检索Pubmed数据库(1998-01/2009-05),以"bone mesenchymal stem cell,osteogenesis"为检索词;应用计算机检索维普数据库(1998-01/2009-05),以"成骨、骨形成蛋白、骨髓间充质干细胞"为检索词。结果与结论:共收集108篇关于骨髓间充质干细胞和骨形成蛋白的文献,中文31篇,英文77篇。排除发表时间较早、实验设计科学性较差的文献,共15篇文献符合标准被纳入。骨髓间充质干细胞其成骨过程在很大程度上取决于诱导分化条件基本辅剂、骨形成蛋白及其他一些细胞因子和激素均在此列,此外多条信号转导通路亦参与调控骨髓间充质干细胞成骨过程热休克蛋白在骨髓间充质干细胞增殖、分化、成组织过程及应对外界刺激的保护效应的信号通路调控机制值得关注。

摘要：背景:骨髓间充质干细胞移植对于运动性脊髓损伤是一种有效的治疗手段。但目前有关脊髓损伤的研究尚不充分,且缺乏对其机制及其良好治疗方法的探讨。目的:通过分析运动性脊髓损伤的病理特征、骨髓间充质干细胞的生理特性,及其运用于脊髓损伤的应用,为制定运动性脊髓损伤的康复治疗方案提供理论依据和科学支撑。方法:应用计算机检索Pubmed数据库(1991/2010),以"Mesenchymal stem cell,sports Kneeinjuries"为检索词;应用计算机检索维普数据库(1991/2010),以"骨髓间充质干细胞、运动性脊髓损伤"为检索词。结果与结论:共收集到85篇文献,排除发表时间较早、实验设计科学性较差的文献,共25篇文献符合标准被纳入。骨髓间充质干细胞能分化为神经元样细胞,反应性分泌各种营养因子及生长因子,以增强神经的保护作用和促进局部微血管再生,从而起到治疗脊髓损伤的作用。但运动性脊髓损伤后损伤部位的缺血、缺氧、运动性自由基的产生及兴奋性氨基酸等影响骨髓间充质干细胞分化及其结果的相关问题仍需要大量的实验研究予以一一证实。

摘要：背景:骨髓间充质干细胞在不同诱导条件下具有向中胚层组织细胞如成骨细胞、成软骨细胞、肌细胞、脂肪细胞等分化的能力。目的:验证用组织工程方法诱导分化骨髓间充质干细胞修复兔关节软骨损伤的效果。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2005-05-03/2007-12-30在沈阳医学院临床中心实验室完成。材料:20只两三月龄的健康新西兰白兔,雌雄不限。方法:①诱导分化体外培养的兔骨髓间充质干细胞。实验组加入地塞米松、碱性成纤维细胞生长因子、维生素C培养1周,再将转化生长因子β替换碱性成纤维细胞生长因子培养3周;以不加诱导剂细胞做对照。②取20只兔,建立膝关节软骨缺损模型,随机分为3组。实验组10只膝关节内植入经诱导的骨髓间充质干细胞;对照组植入未经诱导的骨髓间充质干细胞;空白对照组植入生理盐水。分别于术后2,4,6,8周时处死实验组处死2只,对照组和空白对照组各处死1只进行各项指标检测。主要观察指标:①细胞形态学。②碱性磷酸酶活性的测定。③大体标本观察。④X射线观察。⑤组织切片观察。结果:①经诱导的骨髓间充质干细胞,细胞形态发生明显变化,逐渐由长梭形变为多角形,类似于软骨细胞样形态。②骨髓间充质干细胞经诱导4周后,其碱性磷酸酶活性明显增强(P<0.05)。③术后8周,实验组标本修复组织表面光滑,与周围软骨间界限模糊不清;X射线表现为关节间隙变宽,软骨下骨质囊变得到改善;组织切片观察显示与正常软骨细胞基本上一致。结论:自体间充质干细胞移植可修复关节软骨损伤。

摘要：背景:由于骨髓间充质干细胞能分泌多种对退变胆碱能神经元有保护作用的神经营养因子,因此为阿尔茨海默病的治疗提供了新希望。目的:观察骨髓间充质干细胞分泌物对Aβ1～40损伤PC12细胞凋亡的保护作用。设计、时间及地点:随机分组设计,对比观察,于2008-01/10在中国医科大学神经内科实验室完成。材料:体质量150g左右的SD大鼠,雌雄不拘。方法:在体外培养、纯化骨髓间充质干细胞并收集其培养上清,实验分为4组:①空白对照组:在细胞培养体系中不加入任何药物和上清液。②骨髓间充质干细胞上清液组:细胞接种后24h在细胞培养体系中加入骨髓间充质干细胞上清液30,60,120μL,并用体积分数为5%胎牛血清/RPMl1640将终体积补足至300μL,使其上清液体积分数分别为10%,20%,40%。③Aβ1～40损伤组:以10mg/LAβ1～40刺激PC12细胞,终浓度为5,10,20mg/L;换用1640培养24h后,收集受损PC12上清培养液。④联合培养组:以10mg/LAβ1～40刺激PC12细胞过夜(阿尔茨海默病细胞模型),除去培养上清,换用1640培养24h后,收集受损PC12上清作为条件培养液,分别给予骨髓间充质干细胞上清液30,60,120μL,各组细胞给药后24h和48h进行指标检测。主要观察指标:①骨髓间充质干细胞表面抗原鉴定。②骨髓间充质干细胞分泌物对PC12细胞活力的影响。结果:骨髓单个核细胞培养2～5d为生长潜伏期,细胞增殖较慢,细胞数变化不明显。6～12d为细胞快速增殖期,排列有一定方向性,呈旋涡样生长。培养15～18d,细胞出现80%～90%的融合,克隆间出现重叠。胰酶消化传代的细胞于12h内完全贴壁、伸展并重新变为长梭形,生长迅速,7～10d达到完全融合。骨髓间充质干细胞表面抗原的鉴定通过免疫荧光检测显示,CD45表达为阴性,证明其为非造血类细胞;CD44表达阳性。②Aβ1～40的终浓度为5,10,20mg/L孵育24,48h后,细胞活力与空白对照组相比均降低(P<0.01),且随着Aβ1～40质量浓度的增大,活力降低越明显。与Aβ1～4010mg/L孵育24,48h组相比,联合培养组细胞活力上升,且相邻剂量间两两比较差异均有显著性意义(P<0.05);作用24,48h骨髓间充质干细胞上清液组各浓度组与空白对照组相比,细胞活力没有变化。结论:骨髓间充质干细胞对Aβ1～40损伤的PC12细胞凋亡有保护作用,其保护作用的强弱与骨髓间充质干细胞上清液浓度有关。