摘要：背景:由于心肌细胞自身增殖能力有限,急性心肌梗死后细胞移植是目前流行的再生心肌方法。骨髓间充质干细胞的存活受心肌微环境的影响,而内皮祖细胞参与血管新生,可为骨髓间充质干细胞提供微环境。目的:探讨骨髓间充质干细胞联合中药丹酚酸B预处理的内皮祖细胞共移植后,对急性心肌梗死大鼠心功能改善及骨髓间充质干细胞分化早期基因表达的影响。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2007-01/2008-03在天津中医药大学完成。材料:清洁级雄性Wistar大鼠45只,由中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心提供。丹酚酸B为天津天士力现代中药资源有限公司产品,批号20060601。方法:分别取2只和1只大鼠,采用密度梯度离心法+贴壁筛选法分离培养纯化内皮祖细胞、骨髓间充质干细胞。剩余42只大鼠随机分为4组:假手术组9只、模型组11只、骨髓间充质干细胞组12只、共移植组10只。假手术组只开胸穿线,不结扎左冠状动脉;其余3组结扎左冠状动脉建立心肌梗死模型。结扎冠状动脉15min后再次开胸,共移植组吸取骨髓间充质干细胞悬液250μL(浓度1×1010L-1)+8mg/L丹酚酸B预处理的内皮祖细胞悬液250μL(浓度1×108L-1),于结扎区附近心肌组织分5点注射;骨髓间充质干细胞组同法注射单纯骨髓间充质干细胞悬液500μL,模型组注射等量细胞培养液。主要观察指标:采用超声心动仪测定左室功能,Real-timePCR检测心肌分化基因Nkx2.5,GATA-4的表达。结果:细胞移植4周后与模型组比较,骨髓间充质干细胞组左室结构有改善趋势,但差异无显著性意义(P>0.05);共移植组左室舒张末期内径、左室收缩末期内径、舒张末期室间隔厚度、收缩末期室间隔厚度均明显改善(P<0.05),心室收缩功能指标射血分数、心输出量均明显改善(P<0.05)。细胞移植4周后与模型组比较,骨髓间充质干细胞组、共移植组Nkx2.5及GATA-4mRNA表达均明显增加,且共移植组Nkx2.5mRNA增加幅度明显大于骨髓间充质干细胞组(P<0.05)。结论:骨髓间充质干细胞联合丹酚酸B预处理的内皮祖细胞共移植方式,可上调骨髓间充质干细胞向心肌分化过程中Nkx2.5,GATA-4基因的表达,改善急性心肌梗死大鼠心室结构,增强心功能。

摘要：背景:以往研究证实,骨髓间充质干细胞经体外诱导先分化为神经干细胞,然后分化为神经样细胞,但是对于分化的神经样细胞是否具有电生理特性尚不明确。目的:观察骨髓间充质干细胞诱导分化为神经样细胞的离子通道是否具有电生理特性?设计、时间及地点:观察性实验,于2005-03在华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科实验室完成。材料:4周龄Wistar大鼠37只,雌雄不拘,体质量150g左右。方法:取Wistar大鼠股骨和胫骨,进行骨髓间充质干细胞原代培养,传至第15～20代融合状态的间充质干细胞置于预诱导培养基中培养24h后,换用诱导培养基。在倒置显微镜下连续观察间充质干细胞的形态变化,分别采用免疫组织化学和Western Blot对未经诱导分化的间充质干细胞和诱导后第3天的间充质干细胞进行检测。利用电生理膜片箝技术检测50个骨髓间充质干细胞诱导分化后的神经样细胞。主要观察指标:记录到的钾电流、GABA电流。结果:①诱导分化前呈梭形细胞,在加入预诱导培养基后未出现明显的形态变化,换用诱导培养基1h,胞体开始收缩,出现少数较小的卵圆形或纺锤形细胞,诱导24h后,约60%细胞变成双极形、多极形和锥形,出现类似神经元细胞的形态。②免疫细胞化学检测未经诱导分化的间充质干细胞无NeuN、Nestin、GFAP表达,诱导分化后第3天的间充质干细胞NeuN表达明显增强,有Nestin表达,无GFAP表达。③Western Blot检测在未诱导分化时和预诱导24h,无NeuN、Nestin表达,Nestin表达在诱导分化后6h呈强阳性,在诱导分化24h和48h逐渐减弱。NeuN在诱导分化后6h有表达,在诱导分化后24h和48h表达增强。④在检测的50个细胞中,共有25个细胞检测到ATP电流(50%)、GABA电流13个(26%)、总钾电流46(92%)、复极化钾电流46(92%)。结论:在诱导分化的神经样细胞上存在功能性离子通道,具有电生理特性。

摘要：背景:骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)不仅能分化成间质细胞,而且能向实质细胞(如心肌细胞)转化。在体外定向诱导MSCs分化成神经细胞,是目前国内外研究热点,具有重大理论意义。目的:探讨大鼠MSCs体外诱导分化成神经元的能力。设计:随机空白对照实验的研究。地点、材料和干预:实验在吉林大学公共卫生学院毒理教研室完成。实验动物采用Wistar大鼠(吉林大学实验动物中心),6周龄,雌雄不限。将2～4代的rMSCs接种在铺有盖玻片的24孔板中。分为3个实验组,一个对照组。实验组分别加入终浓度为0.25,0.50和1.00mmol/L异丁基甲基黄嘌呤(isobutylmethylxanthine,IBMX)诱导传代的rMSCs,待细胞分化后进行形态学观察,对照组中不加诱导剂,并用免疫细胞化学方法进行细胞鉴定。主要观察指标:培养MSCs的生长情况,诱导后细胞的形态学变化及nestin(小鼠抗大鼠,单克隆),神经元特异性烯醇化酶(neuron-specificenolase,NSE)抗体(兔抗鼠,多抗)、微管相关蛋白-2a,b(microtubule-associatedprotein-2a,b,MAP-2a,b)的免疫细胞化学检测。结果:加入IBMX后,0.25mmol/L组分化成神经元样细胞较少。1.0mmol/L组细胞加入IBMX第2天开始可见细胞陆续死亡。0.5mmol/L组2d即可见有神经元样细胞出现,细胞具有典型的神经元形态特征。

摘要：背景:目前从大鼠骨髓中分离骨髓间充质干细胞仍以密度梯度离心法为主,虽可提取较纯的骨髓间充质干细胞,但步骤较繁琐,容易污染,且较昂贵。目的:试图寻找一种经济、方便及可靠的骨髓间充质干细胞提取方法。设计、时间及地点:以细胞为对象的对比观察实验,于2008-02/04在南方医科大学珠江医院中心实验室完成。材料:10只健康SD大鼠一侧前后肢提取出的骨髓间充质干细胞为实验组,另一侧前后肢提取出的骨髓间充质干细胞为对照组。方法:将实验组骨髓在含体积分数为0.10～0.15的胎牛血清、100IU/mL双抗及0.1%hepes液的DMEM培养基中培养,用注射器进行吹打,使骨髓与培养基充分混匀,吸取混合液,通过200目的筛网滤过后将其置于培养瓶中培养,提取较纯的骨髓间充质干细胞,对照组采用传统的密度梯度离心法提取骨髓间充质干细胞。主要观察指标:传代至第3代时,采用流式细胞仪鉴定提取的细胞,并从形态及数量上比较两种方法提取的细胞差异。结果:两种方法提取的骨髓间充质干细胞形态无明显差别,流式细胞仪检测通过改良法提取的细胞CD29+、CD44+、CD45-,可鉴定为骨髓间充质干细胞。两组间骨髓间充质干细胞数量无明显差异(P>0.05)。结论:实验采用的改良提取方法具有经济、操作简便等特点,是较为理想的大鼠骨髓间充质干细胞提取方法。

摘要：结合细胞和生物可降解支架的组织工程和再生医学技术为组织、器官的修复和再生提供了一种新途径。骨髓间充质干细胞(BMSCs)具有多向分化潜能,因其取材简单、来源广泛、增殖能力强,无伦理争议,免疫排斥反应小而备受关注。BMSCs在特定区域定向分化成为靶细胞是干细胞治疗的一个重要前提,尤其受到生物材料表面正负电荷、亲疏水和不同的拓扑结构的影响。材料表面涂层蛋白或接枝多肽能够促进BMSCs的分化能力,而生物材料不同的机械性能、几何形状也会影响BMSCs的分化方向。本文综述了近期生物材料调控BMSCs分化的研究结果,为基于BMSCs的组织工程和再生医学材料的设计提供借鉴和指导。

摘要：背景:在适当的生长环境下,中枢神经系统内的一些受损的神经元轴突有少许再生,并能与靶细胞形成功能性的突触联系。目的:比较局部注射和尾静脉注射途径移植骨髓间充质干细胞对大鼠脊髓损伤神经功能恢复的作用。设计、时间及地点:细胞组织学对照观察,于2007-03/2008-04在承德医学院完成。材料:健康成年雄性SD大鼠40只,由解放军军事医学科学院动物中心(北京)提供。方法:取4只大鼠,采用密度梯度离心法和贴壁法体外分离培养骨髓间充质干细胞,传至第2代于临用前24h行BrdU标记。余36只大鼠均建立T12脊髓损伤模型,1周后随机分为3组,局部注射组于损伤部位上下位点注射1×106个骨髓间充质干细胞至损伤大鼠体内;尾静脉注射组通过尾静脉移植等量骨髓间充质干细胞至损伤大鼠体内;模型对照组不行细胞移植。主要观察指标:神经功能缺损BBB评分,苏木精-伊红染色病理学检测,细胞分化免疫组化染色结果。结果:细胞移植后2,4,6周,模型对照组神经功能缺损BBB评分均显著低于局部注射组、尾静脉注射组(F=721.373,F=1114.450,F=1004.099,P均<0.01);局部注射组神经功能缺损BBB评分均显著高于尾静脉注射组(t=55.261,t=71.385,t=78.135,P均<0.01)。苏木精-伊红染色结果显示,模型对照组损伤脊髓组织有较多空腔,横断处形成大量空泡;局部注射组无明显空腔,空泡小而少,间质水肿较轻。移植后4,6周,部分植入的骨髓间充质干细胞呈微管相关蛋白2及胶质纤维酸性蛋白双阳性表达。结论:局部注射和尾静脉注射两种途径移植的骨髓间充质干细胞均可在脊髓损伤处存活、分化并改善神经功能,且局部注射的效果优于尾静脉注射。

摘要：目的研究剪切应力与心肌细胞裂解液联合应用对骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)心肌向分化的影响。方法分离新生乳鼠的心肌细胞并制成心肌细胞裂解液,自成年大鼠骨髓中分离培养BMSCs,分为对照组(A组)、剪切应力组(B组)、心肌细胞裂解液组(C组)和剪切应力+心肌细胞裂解液组(D组)。用RT-RCR、免疫细胞化学染色和Western blotting检测诱导后BMSCs心肌细胞相关因子的表达。结果 B、C、D组均表达心肌细胞相关因子的mRNA和蛋白,D组表达明显高于B组或C组。结论剪切应力与心肌细胞裂解液联合应用可以更好地诱导BMSCs分化为心肌样细胞,为科研和临床应用提供种子细胞,有助于生物反应器的合理设计。

摘要：目的 研究周期性牵张应变对大鼠骨髓间充质干细胞(rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells,rBMSCs)向神经细胞分化的影响。方法 对rBMSCs加载不同幅度周期性应变24 h,然后继续培养5 d,检测神经细胞标志物表达和相关信号通路蛋白磷酸化水平。通过有限元分析牵张作用下细胞表面的应力分布。通过转录组测序分析周期性牵张应变引起差异表达的基因。结果 5%幅度、0.5 Hz周期性牵张应变可以显著促进神经细胞标志物的表达,提高细胞内胞外信号调节激酶(extracellular-signal-regulated kinase,ERK)、蛋白激酶B (AKT)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)的磷酸化水平。KEGG通路富集分析发现,与细胞黏附、细胞外基质和受体相互作用相关的基因在周期性牵张作用后显著提高。结论 周期性牵张应变可以改变细胞与细胞外基质的相互作用,激活AKT/mTOR和ERK信号通路,从而促进rBMSCs向神经细胞分化。了解力学刺激对间充质干细胞分化的影响有望提高干细胞向神经细胞分化的效率,有利于组织工程的装置设计,促进间充质干细胞在神经组织再生和修复的临床应用。

摘要：构建携带针对大鼠维甲酸受体β(Retinoic acid receptorβ,RARβ)基因的siRNA重组腺病毒,并感染全反式维甲酸(All-trans retinoic acid,ATRA)处理的骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs),检测其对RARβ的表达及MSCs成神经分化的影响。设计针对大鼠RARβ的4对siRNA的DNA序列,体外退火形成双链,定向克隆至含有U6/H1双启动子的腺病毒穿梭质粒pSES-HUS,随后与腺病毒骨架质粒pAd-Easy1在BJ5183细菌中同源重组,并在HEK293细胞中包装获得重组腺病毒Ad-siRARβ。腺病毒感染大鼠MSCs后经ATRA处理24 h,Real-time、Western blotting及免疫荧光检测RARβ的表达情况。改良神经诱导培养基(Modified neuronal induction medium,MNM)诱导MSCs神经分化,Real-time PCR及免疫荧光检测神经相关蛋白表达。PCR、酶切及测序鉴定均证实siRNA正确克隆至腺病毒质粒中,腺病毒感染大鼠MSCs后可观察到60%以上的细胞有红色荧光蛋白(Red fluorescent protein,RFP)表达。经ATRA处理24 h,Real-time、Westernblotting及免疫荧光检测发现RARβ表达定位于细胞核,ATRA作用后MSCs中RARβ表达增高16.5±2.34倍(P<0.05),有3组siRNA能有效抑制ATRA诱导的RARβ表达增强,抑制率分别为(66.26±9.12)%、(48.70±5.78)%、(64.09±0.53)%(P<0.05),且以pool组效果最强,抑制率为(78.09±4.24)%(P<0.01)。ATRA联合MNM诱导MSCs成神经样细胞,表达相关神经特异蛋白Nestin、NSE、MAP-2、Tau,免疫荧光结果显示神经标志蛋白Nestin、NSE、Tju1表达阳性细胞率为(50-88)%,而腺病毒介导的siRARβ能有效抑制MSCs的神经标志物表达水平及阳性细胞率(P<0.05)。成功构建了携带针对大鼠RARβ基因的siRNA重组腺病毒,能有效感染MSCs并显著抑制ATRA诱导的RARβ表达增强和MSCs的神经分化。

摘要：背景:目前组织工程生物反应器已对血管、肌腱、软骨、骨、心肌瓣膜、气管、膀胱和干细胞等进行了大量的研究。目的:采用改进的生物反应器系统,应用人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)构建小口径的组织工程血管。设计、时间及地点:单一样本观察,于2005-06/2008-03在华东理工大学机械与动力工程学院和上海组织工程研究与开发中心完成。材料:血管生物反应器为华东理工大学自制;骨髓基质干细胞来自健康志愿者的骨髓。方法:设计一套血管生物反应器系统,采用有限元方法对组织工程小血管托架材料进行分析,从而设计一套用于构建直径为2mm的小血管托架;收集人的原代骨髓基质干细胞进行体外扩增和培养,选用第3代细胞与聚羟基乙酸酯(PGA)复合后置于血管生物反应器中动态培养;培养4周后,对材料复合物取材。主要观察指标:细胞材料复合物生长状况及hBMSCs-PGA复合物的其他相关检测。结果:hBMSCs-PGA材料复合物培养4周取材进行大体观察和扫描电镜观察,形成血管样组织,色泽明亮,有一定的弹性,用镊子反复压下血管能够反弹恢复原样;细胞分泌的胶原基质排列较规则,免疫组织化学结果表明血管含有平滑肌弹性肌动蛋白的成分。结论:改进的血管生物反应器能模拟血管的力学环境,并能利用hBMSCs成功构建组织工程化小血管组织。