摘要：设计合成了2-乙烯基取代的8-羟基喹啉衍生物(6),用IR,UV-Vis,1H NMR,MS和元素分析确认其结构;利用二苯代苦味酰基自由基(DPPH.)法和噻唑蓝比色(MTT)法分别测定了目标产物的抗氧化活性及调控鼠骨髓间质干细胞(MSCs)增殖的作用.结果表明,目标产物有较强的抗氧化活性,随着产物浓度的增加,其抗氧化活性先增强后减弱;在低浓度时对鼠骨髓间质干细胞有促进作用.研究发现,化合物6抗氧化活性的提高与其含量相关.

摘要：设计合成了5-[2-(8-羟基喹啉-2-基)乙烯基]-2-甲基-8-羟基喹啉(5),用IR,UV,1HNMR,MS和元素分析确认其结构.利用DPPH·法和噻唑蓝比色法(MTT法)分别测定了目标产物的抗氧化活性及调控鼠骨髓间质干细胞(MSCs)增殖的作用.结果表明,目标产物有较强的抗氧化活性,在低浓度时对鼠骨髓间质干细胞有促进作用.

摘要：设计合成了3-[2-(8-羟基喹啉基)-乙烯基]-N-对甲苯基咔唑(8)和3-[2-(8-羟基喹啉基)-乙烯基]-N-对甲氧苯基咔唑(9)两个新的化合物,用IR,MS,1HNMR和元素分析确认其结构.并利用DPPH·方法,超氧阴离子自由基(O2-·)法,羟基自由基HO·法和噻唑蓝比色法(MTT法)分别测定了目标产物的抗氧化活性和调控鼠骨髓间质干细胞(MSCs)的作用.结果表明,这两种化合物对DPPH·自由基、超氧阴离子自由基和羟基自由基具有较强的抗氧化活性,化合物9在低浓度时对鼠骨髓间质干细胞增殖有很好的促进作用.

摘要：为深入研究CXCR4在骨髓间质干细胞(MSCs)体内迁移中的作用,构建CXCR4基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体并实现其在大鼠MSCs(rMSCs)中表达。根据大鼠CXCR4 mRNA序列,设计并合成包含各靶序列的互补DNA链,插入pSUPER载体的H1 RNA启动子后面,产生pRiCXCR4,将其中的CXCR4 shRNA表达结构酶切插入慢病毒载体质粒pNL-EGFP,产生pNL-RiCXCR4-EGFP。在脂质体介导下与包装质粒pHELPER和包膜质粒pVSVG共转染293T细胞,包装生产慢病毒,测定慢病毒功能滴度。慢病毒转导rMSCs后,用Real-time RT-PCR、Western blotting和流式细胞术检测RNAi组(CXCR4a、CXCR4b和CXCR4c)、空载体组(Mock)和对照组(Control)中CXCR4表达情况。结果显示,酶切和测序证实pRiCXCR4质粒构建正确,产生能同时表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和CXCR4 shRNA的慢病毒载体质粒pNL-RiCXCR4-EGFP,未浓缩和浓缩慢病毒悬液的功能滴度分别为6.4×104TU/mL和6.9×106TU/mL。慢病毒转导rMSCs 48 h后,与空载体组和空白组相比,3个RNAi组均不同程度抑制CXCR4表达,CXCR4b-MSC组在mRNA水平抑制了95.6%,抑制作用最明显。大鼠CXCR4基因RNAi慢病毒载体构建成功,为深入研究CXCR4在rMSCs向损伤组织定向迁移的作用奠定了基础。

摘要：目的构建含有人骨形态发生蛋白2(human bone morphogenetic protein 2,hBMP2)cDNA的重组慢病毒DNA,在293T细胞中进行慢病毒包装和表达检测。用慢病毒感染大鼠骨髓间质干细胞后,观察其向成骨细胞分化的情况。方法从GenBank中调出hBMP2基因序列,设计带有NheⅠ、AgeⅠ酶切位点引物。从人肝脏组织中抽提总RNA,再反转录成cDNA,扩增出hBMP2 cDNA的全长序列。测序验证后克隆到慢病毒载体pHIV-CS-CDF-CG-PRE上,通过PCR扩增、酶切、测序等方法鉴定重组慢病毒DNA。将该重组慢病毒DNA同辅助质粒一起共感染293T细胞,通过重组而包装成能表达hBMP2基因的有活性的慢病毒。慢病毒感染大鼠骨髓间质干细胞,通过碱性磷酸酶(AP)、钙沉积定量测定、Ⅰ型胶原蛋白表达观察干细胞向成骨细胞转化的情况。结果①扩增出1.2 kb左右的hBMP2全长cDNA与GeneBank中的hBMP2阅读框架序列完全一致;②成功构建和克隆了含hBMP2基因的慢病毒重组DNA(pHIV-hBMP2);③对重组慢病毒DNA进行了成功包装和分析。④大鼠骨髓间质干细胞感染慢病毒后,碱性磷酸酶分泌增加,钙沉积增加,Ⅰ型胶原蛋白表达增加,成功向成骨细胞转化。结论重组慢病毒携带hBMP2基因感染大鼠骨髓间质干细胞可以使其向成骨细胞定向分化,为组织工程研究提供良好的种子细胞。

摘要：背景:药物治疗阿尔茨海默病难以达到满意效果,而多项研究表明,骨髓间质干细胞移植治疗帕金森病、脑缺血等有效,但其治疗机制尚不十分清楚。目的:采用淀粉样β1-40蛋白损伤的PC12细胞与骨髓间质干细胞共育,模拟移植环境,观察共育微环境中细胞间双向信息反馈对骨髓间质干细胞向神经细胞转分化的作用及对抗损伤的PC12凋亡的保护作用。设计:对比观察实验。单位:中国医科大学神经内科。材料:选用出生两三周的SD大鼠,雌雄不拘。PC12细胞株购自中国科学院细胞生物研究所。神经元特异性烯醇化酶(1∶50,博士德,武汉);MTT15μL(终浓度0.5g/L)。方法:实验于2004-06/07在中国医科大学实验中心完成。取1只SD大鼠双侧股骨骨髓,并培养骨髓间质干细胞,以CD44抗体用免疫荧光鉴定骨髓间质干细胞。PC12在实验中作为神经细胞的替代细胞。淀粉样β1-40蛋白刺激PC12后,用转移筛网转移PC12。实验分5组,A组:正常培养的PC12+骨髓间质干细胞共育;B组:淀粉样β1-40蛋白刺激的PC12+MSCs共育;C组:正常PC12的培养上清+骨髓间质干细胞;D组:受损PC12上清+骨髓间质干细胞;E组:普通1640培养的骨髓间质干细胞。主要观察指标:按常规进行细胞的免疫化学染色,采用荧光倒置显微镜观察神经元特异性烯醇化酶阳性细胞,随机选取10个200倍的视野,计数阳性细胞数。用四甲基偶氮唑盐代谢率(四唑盐比色试验)检测各组骨髓间质干细胞增殖情况。结果:①骨髓间质干细胞的生长:以荧光和明视野在同一视野下观察,骨髓间质干细胞生长良好,CD44免疫荧光鉴定,见95%以上细胞呈阳性表达。②神经元特异性烯醇化酶阳性细胞:以荧光和明视野在同一视野下观察,神经元特异性烯醇化酶阳性的骨髓间质干细胞呈现红色荧光,骨髓间质干细胞形态为双极形、多极形和锥形,出现类似神经元样细胞的形态,似树突样突起结构,个别神经元样细胞之间有广泛的联系。B组神经元特异性烯醇化酶细胞阳性率明显高于其他组(F=34.82,P<0.01)。③骨髓间质干细胞增殖情况:四甲基偶氮唑盐代谢率以B组最低,与其他比较,差异有显著性意义(F=9.713,P<0.01)。结论:淀粉样β1-40蛋白损伤PC12与骨髓间质干细胞非接触共培养的微环境细胞最有利于骨髓间质干细胞向神经元样分化,而非增殖方向发展。

摘要：背景:目前肝纤维化尚没有公认的特效疗法,近年来骨髓间质干细胞应用于肝纤维化的治疗已取得一定效果,但具体机制仍不明确。目的:体外探讨人骨髓间质干细胞对肝星状细胞的调控作用。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-06/12在中山大学干细胞与组织工程研究中心、中山大学第三附属医院中心实验室完成。材料:骨髓来源于青年健康志愿者髂骨,人肝星状细胞购自中山大学实验动物中心,人正常肝细胞系L-O2购自中山大学实验动物中心。方法:将分离提纯的人骨髓间质干细胞与肝星状细胞在6孔Transwell板上建立上下共培养体系,接种密度均为2×104cells/well。另设L-O2代替人骨髓间质干细胞作为阴性对照,单纯培养的肝星状细胞为空白对照,培养72h。主要观察指标:肝星状细胞形态及免疫细胞化学染色结果,流式细胞仪检测肝星状细胞凋亡情况,Westernblot法检测肝星状细胞活化标志α-肌动蛋白的表达。结果:倒置显微镜下活化的肝星状细胞呈扁平状,胞浆内缺乏脂肪滴,α-肌动蛋白位于肝星状细胞胞质内,呈高张力纤维状分布。与L-02+肝星状细胞组、单纯肝星状细胞组比较,骨髓间质干细胞+肝星状细胞共培养组的肝星状细胞凋亡率明显升高(P<0.05),α-肌动蛋白表达水平明显下调。结论:人骨髓间质干细胞可抑制肝星状细胞活化,促进其凋亡,这可能是骨髓间质干细胞抗肝纤维化的作用机制。

摘要：背景:研究发现骨髓间质干细胞在体外专门的诱导体系中能产生类似神经元烯醇化酶克隆球样神经球结构,故骨髓间质干细胞成为中枢神经损伤修复种子细胞的热门候选。目的:观察体外分化体系诱导大鼠骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞的情况。设计:观察性实验。单位:深圳市第二人民医院脊柱外科。材料:选用孕16d及2月龄的SD大鼠,由华中科大同济医学院动物中心提供。神经元烯醇化酶单抗、胶质纤维酸性蛋白多抗、神经中丝蛋白单抗均购自武汉博士德公司。方法:实验于2006-09在华中科技大学同济医学院基础医学部免疫室开放实验室及本院中心实验室完成。取大鼠下肢骨,离心分离鼠骨髓间质干细胞。提取孕16d大鼠胚胎脊髓组织匀浆,制备诱导液,诱导骨髓间质干细胞的分化。另取胚胎肌组织同法制备肌组织匀浆作对照。主要观察指标:对诱导后骨髓间质干细胞进行形态学观察及用抗神经元烯醇化酶、NF200、抗胶质纤维酸性蛋白分别标记神经元,星形胶质细胞。反应阳性诱导细胞免疫组化染色后光镜下随机数取10个非重叠视野进行观察,计算神经元烯醇化酶和神经中丝蛋白阳性细胞占总细胞数的比例。结果:①大鼠骨髓间质干细胞在诱导后细胞形态变化:诱导早期光镜下即见部分细胞胞体回缩,突起变长,变细;逐渐出现分化细胞突起生长,并相互交织,类似神经细胞,有的分支类似树突状分枝,对照组细胞形态变化不大。②诱导1周后,骨髓基质干细胞向神经元样细胞分化相关抗原表达情况:脊髓匀浆组多数细胞表现为神经元烯醇化酶和神经中丝蛋白阳性;少数细胞表达胶质纤维酸性蛋白,对照组无神经细胞抗体阳性染色出现。而对照组未见神经细胞抗原反应阳性。免疫组化发现分化细胞神经元烯醇化酶、神经中丝蛋白表达阳性率分别为(68±1.7)%,(76.2±2.9)%。结论:胚胎脊髓组织匀浆可诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞。

摘要：背景:虽然近年来对小鼠骨髓间质干细胞分离培养的报道层出不穷,但就其方法而言,有的操作步骤过于繁琐,有的不适用于国内相关实验,如采用一系列抗体负选或利用自行研制的新抗体筛选。目的:拟建立简便稳定的小鼠骨髓间质干细胞体外分离和扩增的方法,并比较不同品系小鼠骨髓间质干细胞的生物学特点。设计、时间及地点:细胞学体外对比观察,于2007-04/09在中山大学中山医学院病理生理教研室完成。材料:清洁级6周龄雄性C57BL/6和BABL/C小鼠各5只,由中山大学中山医学院实验动物中心提供。方法:取两种品系小鼠双侧股骨,去除股骨上附带组织,用含10% FCS的DMEM培养基冲洗骨髓腔,过200目不锈钢网,收集骨髓细胞,用Tris-NH4Cl红细胞裂解液溶解2min,用含10% FCS的DMEM培养基调整细胞浓度,按500个细胞/孔低密度接种于24孔板,置于37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中。出现成纤维样细胞克隆后消化收集并移至6孔板,待细胞70%～80%融合时消化传代。主要观察指标:细胞形态和生长特点,流式细胞仪检测细胞表型,茜素红染色观察成骨诱导情况,油红O染色观察成脂诱导情况。结果:约培养2周可形成细胞克隆,经历一缓慢扩增阶段后,第6～7代细胞生长明显加快,可见形态均一的成纤维细胞群,呈典型的旋涡状生长,两种品系小鼠骨髓间质干细胞均可传至10代以上,但C57BL/6小鼠骨髓间质干细胞体外扩增能力更强。C57BL/6和BABL/C小鼠骨髓间质干细胞均呈CD45-CD11b-CD117-,CD44和Sca-1呈阳性表达,可连续表达MHC-I,少量表达CD80,此外前者可少量表达MHC-Ⅱ,而后者几乎不表达MHC-Ⅱ。两者体外均能够向成骨、成脂方向分化。结论:通过低密度培养技术可简单方便的体外分离并扩增C57BL/6和BALB/c小鼠骨髓间质干细胞。两品系小鼠骨髓间质干细胞均易向成骨成脂分化,但在扩增能力、细胞表型上略有不同。

摘要：背景:目前广泛应用于骨髓间质干细胞的标记方法主要为绿色荧光蛋白标记法,但标记与固定程序复杂,操作繁琐,易出现偏差。氯甲基苯甲酰氨(Chloromethyl-benzamidodialkylcarbocyanine,CM-Dil)是亲脂性膜荧光染料,能够与含有肽和蛋白质的硫氢基结合进而标记整个细胞。目的:探讨CM-Dil对大鼠骨髓间质干细胞体内示踪的可行性。设计、时间及地点:体内外细胞学观察,于2007-05/12在中山大学干细胞与组织工程研究中心、中山大学动物实验中心完成。材料:SPF级Wistar大鼠40只,由中山大学实验动物中心提供。CM-Dil为美国Sigma公司产品。方法:在体外,以标记CM-Dil的骨髓间质干细胞作为实验组,以未标记CM-Dil的骨髓间质干细胞作为对照组,比较两组细胞生长与增殖情况,MTT法检测细胞生长增殖情况。在体内,分别将标记CM-Dil的骨髓间质干细胞经门静脉移植及肝内培养,于移植后第7,15,21,30天制备肝脏切片。主要观察指标:骨髓间质干细胞CM-Dil标记率,标记细胞在肝内定植、生长与分布。结果:体外培养结果显示,两组骨髓间质干细胞在细胞生长、增殖、分裂以及形态学上均基本相似,在绿色光激发下,CM-Dil发出红色荧光,24h后细胞标记率为100%,21d后CM-Dil标记的骨髓间质干细胞荧光开始淬灭。体内实验中,经门静脉移植的骨髓间质干细胞在肝脏内主要位于间质,呈椭圆形或不规则形的分化细胞;肝内培养的骨髓间质干细胞在培养孔内呈"贴壁生长",为椭圆形分化细胞,未发现骨髓间质干细胞进入并定植于肝组织内;CM-Dil标记的骨髓间质干细胞荧光开始淬灭的时间亦为21d。结论:CM-Dil染色简单、方便、稳定,荧光开始淬灭时间较长,可望成为大鼠骨髓间质干细胞体内示踪的新方法。