摘要：本研究采用基因组高通量随机测序的方法对青石斑鱼(Epinephelus awoara)微卫星标记进行了发掘,结果共获得青石斑鱼(Epinephelus awoara)基因组原始数据2.860G。采用MISA(MIcroSAtellite)软件进行微卫星位点搜索,获得967 657条微卫星序列。随机选取了96条微卫星序列设计引物并利用8尾青石斑鱼个体进行多态性位点筛选,共获得60个具有多态的微卫星标记。利用其中16个微卫星标记对一个青石斑鱼亲鱼群体的种群遗传学特征进行评价,共检测到129个等位基因,单个标记的表观等位基因数(NA)分布范围为2~14,平均为7.167;表观杂合度(HO)分布范围为0.422~1.000,平均为0.678 6;期望杂合度(HE)分布范围为0.481~0.893,平均为0.676 8。有5个标记的等位基因频率不符合"哈迪-温伯格平衡",其中EAW-55596、EAW-21755、EAW-30334 3个标记表现为杂合子显著缺失(P0.5,说明该亲鱼群体的遗传多样性比较高。而这些微卫星标记将对于青石斑鱼的遗传变异分析、亲缘关系鉴定提供了技术支持,这也将为青石斑鱼的分子遗传育种奠定了基础。

摘要：目的建立基于多重PCR的人3型腺病毒(human adenovirus 3,HAdV-3)全基因组高通量测序方法,提高HAdV-3全基因组测序效率和成功率。方法设计适用于HAdV-3全基因组扩增的多重PCR引物,通过多重PCR扩增HAdV-3全基因序列,使用琼脂糖凝胶电泳初步验证扩增产物的特异性。使用Illumina二代测序对多重PCR产物进行高通量测序。获得序列后使用CLC、IGV等软件分析测序有效数据量、平均深度及全基因组覆盖度等质量参数,评估测序质量。基于全基因组测序结果构建系统发育树,确认病毒型别及分析序列的同源性,评价该方法的准确性。结果设计得到HAdV-3全基因组多重PCR扩增引物共计70条(35对),扩增子大小约1200 bp,预期基因组全长约35240 bp、全基因组覆盖度可达99.8%;电泳结果显示多重PCR产物大小与预期相符且扩增特异性高;高通量测序结果显示基于该方法所获病毒全基因组序列完整无缺失,基因组覆盖度达预期范围;序列质量分析显示基于多重PCR的高通量测序方法能获得更多有效数据和更大测序深度,全基因组覆盖更均匀;进化分析显示病毒DNA经多重PCR扩增再测序与病毒DNA直接测序所获序列的进化分型结果一致且同源性高,表明该多重PCR方法的扩增忠实性高,结合高通量测序所获序列结果准确。结论本研究成功建立了一种基于多重PCR的HAdV-3全基因组高通量测序方法,该方法能够提高HAdV-3全基因测序效率和成功率,旨在为基于全基因组测序的HAdV-3病原监测及疫情溯源提供更好的技术支持与参考。

摘要：背景目前的临床遗传诊断中,外显子组捕获测序(ES)和全基因组测序(WGS)均有广泛的应用场景且在综合性价比和变异检测范围等方面各有优势;建立支持两种不同建库策略测序方案的整合性遗传诊断流程,是进一步提高遗传诊断敏感性和检测效率的关键。目的整合ES以及WGS场景下的多变异类型分析、遗传病复杂临床表型的标准化与结构化、表型导向的遗传变异分析系统,建立从临床检测申请到遗传报告反馈的一体化流程。设计流程开发。方法(1)建立复旦大学附属儿科医院高通量测序数据一体化全流程闭环分析系统(复旦流程3.0)各个模块:①病史处理,②结构化遗传表型,③测序实验,④变异检测,⑤变异解读,⑥质控复核,⑦基因型表型联合分析。(2)代表性病例重测分析:根据结论性变异的类型和诊断难度选择代表性病例,展示代表性病例从病史处理开始到报告草稿为止各模块的运行情况。主要结局指标代表性病例分析过程中的结构化表型、数据质控、变异检测及解读、最终诊断。结果对3例代表性病例的重分析中,分别进行了经济版家系WGS、先证者WGS以及ES;病史成功提取结构化表型;FastQ及BAM文件结果数据质控良好;检测到的变异经解读之后进行基因型表型联合分析,分别检测出3例病例的复杂遗传模式。例1:ANTXR2基因点突变NM_058172:c.1294C>T与4q21.22约13 kb的结构变异缺失形成隐性纯合致病;例2:线粒体MT-ND6基因致病变异m.14459G>A,异质性>99.5%;例3:SMN1基因纯合致病变异NM_000344:c.863G>T合并SMN1基因单拷贝缺失。结论复旦流程3.0可整合ES和WGS数据,处理不同类型的变异结果,最终形成遗传诊断,且对复杂变异类型有高效处理能力。

摘要：目的通过小单链RNA高通量测序方法分析小单链RNA分子在血清中的稳定性,为获得研发小RNA药物的序列特点提供基础。方法人工合成21nt随机序列小单链RNA分子库,用血清孵育后回收小单链RNA分子,进行高通量RNA测序,对测序结果进行比较分析。结果与结论人工合成的不同序列小单链RNA分子在血清中存在稳定性差异,稳定性小单链RNA分子呈现出碱基偏性和基序特征。上述结果将为小RNA分子药物设计和筛选提供参考。

摘要：【目的】研究运用基于高通量测序的技术检测梨树病毒,为梨树病毒的检测提供新方法。【方法】于2014年、2017年、2018年4月中旬采集库尔勒香梨花朵若干,分别进行转录组测序,将得到的序列经过转录本拼接、层次聚类和基因功能注释,筛选出注释为植物病毒的序列作为候选病毒序列。利用RT-PCR方法检测随机采集的香梨枝条样品,验证高通量测序结果的可靠性。【结果】根据3组转录组测序数据的生物信息学分析结果,分别对注释为来源于植物病毒的66、202和921条基因序列进行分析。3种梨树中已报道的病毒,分别是苹果茎痘病毒、苹果茎沟病毒和苹果褪绿叶斑病毒,以及梨树中未报道的芸薹黄化病毒。采用设计的特异性引物,通过RT-PCR技术对筛选出的4种病毒进行扩增验证,结果扩增出苹果茎痘病毒和苹果茎沟病毒的目的片段。【结论】高通量测序技术可作为检测梨树病毒的一种快速、有效手段。

摘要：本研究采用Illumina MiSeq高通量测序技术对新疆塔城和内蒙古锡林郭勒奶豆腐中的细菌结构和多样性进行解析,进而为奶豆腐的工业化和安全化生产提供数据支持。结果发现奶豆腐中优势菌门主要为Firmicutes(硬壁菌门,69.56%)和Proteobacteria(变形菌门,20.35%);优势细菌属主要为Lactococcus(乳球菌属,28.52%)、Lactobacillus(乳杆菌属,26.77%)和Streptococcus(链球菌属,5.23%)。不同地区奶豆腐中优势菌属相对含量和低丰度菌属的组成存在较大差异。通过冗余分析发现,乳球菌属和乳杆菌属是造成塔城和锡林郭勒奶豆腐菌群结构差异的关键优势菌属。由此可见,乳酸菌是奶豆腐中的主要细菌类群,且不同地区制作的奶豆腐中细菌群落结构存在较大差异。

摘要：目的建立基于高通量测序技术的实验动物沙门氏菌检测方法,应用于实验动物沙门氏菌的检测。方法提取小鼠粪便DNA样本,分别针对16S r DNA区域、23S r DNA区域、16S^23S r DNA IS、23S^5S r DNA IS、gyr B优选区域设计通用引物,对各个引物进行测试分析,优化扩增条件并建库,利用Illumina高通量测序技术检测区分42个样本中的沙门氏菌,评价该方法的特异性和稳定性。结果筛选发现沙门氏菌的菌种分类优选区域为gyr B基因,gyr B基因引物序列为FP5’-AACCACCGCAATCAGACCTT3’,FP5’-AGCCACGAAACCTTCACYA-3’。对引物进行优化,确定最佳扩增条件及样品上样量并正式建库,通过高通量测序和序列分析能检测出42个样品中极微量的沙门氏菌,检测方法稳定,灵敏度高,检测限可达0~102的cfu。结论本实验利用高通量测序技术,建立了一套完整检测实验动物沙门氏菌的生物体系,能检测出实验动物体内极微量的沙门氏菌,检测方法稳定性好,灵敏度高,可沿用至其他种类病原微生物的检测。

摘要：为了更深入开展珊瑚遗传结构及其多样性研究,本研究采用高通量测序对鹿角杯形珊瑚进行微卫星标记的开发。首先用人工白化的方法获得污染较低的鹿角杯形珊瑚,然后使用该样品DNA,基于高通量测序平台对鹿角杯形珊瑚简化基因组进行了测序,最终设计得到鹿角杯形珊瑚微卫星引物2786对。利用海南三亚鹿角杯形珊瑚对其中6对多态性较高的微卫星标记进行了评价。每个微卫星位点的有效等位基因数(Ne)为2.198~5.000;观测杂合度(Ho)为0.531~0.875;期望杂合度(He)为0.512~0.816;Shannon多样性指数为0.856~1.829;多态信息含量(PIC)为0.441~0.777,其中有4对微卫星标记呈现为高度多态性(PIC>0.5),2对微卫星标记为中度多态性。经过Bonferroni校正后,只有微卫星标记LB11偏离哈迪—温伯格平衡;连锁不平衡检验结果表明,位点之间不存在连锁不平衡现象。

摘要：遗传病是由于遗传物质的改变或者亲代所遗传的致病基因导致的,通过基因检测可以确诊遗传病.目前对于遗传病的治疗只有后天通过手术或者药物改善,但是这些方式无法从根本上治愈疾病,且可能存在伦理道德的问题.随着生物医疗技术的飞速发展,通过高通量测序(High-throughput sequencing)技术从患者的全基因组中找到致病变异的位置,用基因编辑(Gene Editor)技术修复变异基因从而治愈遗传病已经成为可能.但从庞大的基因组数据中找到遗传病的致病变异是一个繁琐复杂的问题.作者设计了一个针对遗传病样本全基因组数据的分析流程,该流程高效、针对性强、简单易于操作,得到的结果实用性强,将其应用于一例遗传病,迅速找到了这例遗传病的致病突变.该流程具有较强的通用性,可应用于大多数的遗传病诊断分析.

摘要：目的通过调整建库过程中的测序接头加入量、片段选择的执行与否、文库扩增循环数等条件,建立一种基于Illumina测序平台的高效稳定的痕量样本高通量文库构建方法。方法采用不同类型的样本,设计不同起始DNA量(最低至0.1 ng)的文库构建策略,主要对接头使用量、扩增循环数等进行优化,并通过数据分析评估文库质量。结果对于起始量低至0.1 ng的DNA样本,基因组文库构建成功率达100%。对于基因组较小的细菌,0.1 ng的起始DNA量的数据组装效果与100 ng起始DNA量相近;对于基因组较大、结构复杂的细菌,0.1 ng的起始DNA量的数据组装效果显著差于100 ng起始DNA量,但可通过增加测序数据量的方法提高组装效果。对于元基因组测序,起始DNA量为1ng时,制备的测序文库与常规起始DNA量制备的文库得到的微生物群落结构相近。结论本研究建立的0.1 ng起始DNA量文库构建方法稳定,可用于更多微生物基因组测序、元基因组测序的应用领域。