摘要：目的提取临床分离的鲍曼不动杆菌外膜蛋白A(OmpA)的基因,并进行生物学预测和分析。方法查询鲍曼不动杆菌OmpA基因序列,设计特异性PCR引物,以提取的鲍曼不动杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增OmpA片段。回收目的片段,采用生物信息学软件分析OmpA蛋白的生物学特性。结果12株鲍曼不动杆菌多位点序列分型(MLST)序列分析有6个ST分型,分别是ST 208、ST 229、ST 191、ST 195、ST540、ST 1145,鲍曼不动杆菌OmpA基因序列全长为1070 bp的,单核苷酸多态性(SNP)位点较少,预测蛋白为跨膜蛋白,具有6种三级结构,均由β-桶状结构组成的保守结构域。结论临床分离的不同鲍曼不动杆菌株OmpA蛋白为结构相对保守的跨膜蛋白,具有维持细胞的形状和稳定性,参与细菌耐药机制及免疫原性作用。

摘要：近年来,鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)在医院里越来越受到人们的关注,尤其是在重症监护病房(ICUs).它以强大的多重耐药性(multiresistance)而闻名.核苷二磷酸激酶(nucleoside diphosphate kinase,NDK)是一种进化上非常保守的酶,它能催化核苷之间磷酸基团的转移.我们解析了鲍曼不动杆菌NDK野生型和C端氨基酸残基Arg141-Thr142-Arg143(RTR)截短突变体的结构.通过和黄色黏菌(Myxococcus xanthus)NDK的三维结构进行比较,推断鲍曼不动杆菌NDK的催化机制和黄色黏菌类似.通过激酶活性实验和圆二色谱实验,发现鲍曼不动杆菌NDK E28A突变体二级结构发生了改变,从而导致蛋白催化活性降低,说明Glu28是鲍曼不动杆菌NDK结构中非常关键的氨基酸残基.鲍曼不动杆菌NDK C端RTR截短突变体显示出催化活性极大的降低,这可能与C端RTR残基介导的二体间相互作用有关.虽然RTR截短突变体中的Lys33伸向了和野生型中不同的方向,和Val15产生相互作用弥补了一部分因为RTR截短丢失的相互作用,维持了RTR截短突变体和野生型类似的结构.但是,Lys33产生的相互作用依然太弱,不足以维持蛋白在催化的动态过程中整体结构的高效转换.我们解析的鲍曼不动杆菌NDK晶体高分辨率结构将有助于科学家设计针对鲍曼不动杆菌的药物.

摘要：目的获取鲍曼不动杆菌Ⅵ型分泌系统(T6SS)核心组分溶血素共调节蛋白(Hcp)。方法根据ATCC17978菌株Hcp基因序列设计并合成一对含XhoⅠ和NcoⅠ酶切位点的特异性引物,利用PCR方法扩增Hcp基因全长,定向克隆至含His标签的pET-28a(+)载体,采用PCR、双酶切和测序技术验证载体是否构建成功,进而转化Escherichia coli(***)BL21(DE3)菌株,以IPTG诱导表达Hcp蛋白,分析目的蛋白的表达方式及最佳表达条件,通过Western blot鉴定目的蛋白,超滤管浓缩并保存。结果获得了预期500bp左右的Hcp基因,并成功克隆至pET-28a(+)质粒,经IPTG诱导表达,成功纯化出Hcp融合蛋白。结论成功获得鲍曼不动杆菌Hcp基因的原核表达产物,为深入研究T6SS及Hcp奠定了基础。

摘要：目的了解鲍曼不动杆菌TEM基因及氨基糖苷类修饰酶基因存在情况,为耐药性监测提供初步依据。方法在2002年8月—2004年2月间自临床分离20株鲍曼不动杆菌,采用微量稀释法测定其对13种抗菌药物的敏感性,采用聚合酶链反应及序列分析的方法分析TEM基因及氨基糖苷类修饰酶基因类型。结果20株鲍曼不动杆菌对亚胺培南、美洛培南全部敏感,哌拉西林/他唑巴坦、头孢吡肟及头孢他啶的耐药率分别为450%、650%和700%,氨基糖苷类抗生素的耐药率为750%,对其他抗菌药物的耐药率均在650%以上。TEM、aac(3)Ⅰ、aac(3)Ⅱ、aac(6”)Ⅰ和ant(3”)Ⅰ基因的阳性率分别为450%、550%、150%、350%和600%,而SHV、AmpCDHA、AmpCMIR基因均阴性。结论本院临床分离的鲍曼不动杆菌多重耐药严重,TEM型基因及氨基糖苷类修饰酶基因携带率较高。由于引物设计不完全,常见的OXA、VEB、PER基因未进入试验,因此第三、四代头孢菌素耐药原因需进一步研究。

摘要：目的研究NDM-1鲍曼不动杆菌厦门分离株耐药性产生的分子机制。方法 Vitek32测定耐药谱。根据Gen-Bank发表blaNDM-1基因序列设计合成引物,利用PCR技术扩增NDM-1鲍曼不动杆菌的blaNDM-1结构基因及其上下游调控序列片段,连接T载体,转化至大肠杆菌*** DH5α,序列测定并进行BLAST分析比对。测定始发菌株与重组菌株对美洛培南的最小抑菌浓度。结果药敏试验结果显示,该菌株对碳青霉烯类及β-内酰胺类抗生素耐药。NDM-1鲍曼不动杆菌厦门分离株blaNDM-1基因与HK-01同源性为100%;与KP-05-506相比,在blaNDM-1和trpF之间有24bp的插入。美洛培南最小抑菌浓度测定结果表明,重组菌株*** DH5α(pMD18-T::blaNDM-1)MIC值比始发菌株*** DH5α升高256倍。结论获得blaNDM-1基因的大肠杆菌能够表达碳青霉烯酶,该基因是碳青霉烯类抗生素耐药性产生的分子基础,该基因具有跨种水平传播的可能。

摘要：目的建立OmpA过表达慢病毒载体并观察其对RAW264.7细胞NLRP3炎症小体的激活。方法以鲍曼不动杆菌ATCC 19606为模板,设计引物扩增OmpA基因,将其克隆至慢病毒表达载体pCDH-MSCV-copGFP中。将此表达质粒和辅助质粒共转染HEK293T细胞包装病毒,浓缩病毒上清液并用GFP报告基因法测定病毒滴度;用包装病毒颗粒感染RAW264.7细胞48h,Real-time PCR法检测OmpA的mRNA表达水平,用Western blot法检测OmpA蛋白以及感染后NLRP3炎症小体相关蛋白。结果成功构建OmpA过表达慢病毒载体并在HEK293T细胞中包装得到病毒,经测定病毒滴毒为1.5×109 TU/mL;重组OmpA病毒感染RAW264.7细胞表达OmpA蛋白,该蛋白能引起NLRP3炎症小体激活。结论成功构建OmpA过表达慢病毒载体并证明OmpA可激活RAW264.7细胞NLRP3炎症小体。

摘要：鲍曼不动杆菌已成为最普遍的医院致病菌,且耐药情况严峻.LpxC作为新抗菌药物靶点被大量研究,但鲍曼不动杆菌LpxC晶体尚未解析得到,基于其结构的药物设计等工作无法开展.以铜绿假单胞菌LpxC晶体结构为模板,通过同源模建方法获得鲍曼不动杆菌LpxC结构模型.较好的Ramachandran plot分布和Profile-3D结果验证了模型的合理性.用分子动力学模拟优化鲍曼不动杆菌LpxC模型,修补部分不合理构象.后续分子对接结果显示S构型的苄氧乙酰基羟肟酸类抑制剂比R构型分子能更有效地结合在F191,H237和K238组成的较浅口袋中,这可能是S构型抑制剂活性更高的主要因素,模拟结果与实验数据吻合较好.

摘要：目的克隆表达及纯化鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)普遍应急蛋白A(Universal stress protein ***).并进行生物学预测和分析。方法查询鲍曼不动杆菌UspA基因序列,设计特异性PCR引物,以提取的鲍曼不动杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增UspA片段。回收目的片段,连接到质粒pET28a.转化大肠埃希菌.37℃培养后,进行PCR扩增并测序。将重组质粒转入表达菌,加人IPTG诱导重组UspA蛋白表达.并经Ni2+亲和层析纯化。采用生物信息学软件分析UspA蛋白的生物学特性。结果获得全长为444 bp的鲍曼不动杆菌UspA基因,且成功构建了重组质粒pET28a-UspA.得到纯度较高的相对分子质量17X103的重组UspA蛋白。该蛋自为细菌的胞质蛋白,其a-螺旋占51%,延伸链占27%,无规卷曲的含量占31%。由2个同源UspA蛋白分子构成二聚体。结论成功克隆表达了鲍曼不动杆菌UspA蛋白。该蛋白可能含B细胞表位,而具有免疫原性,为其生物学活性及耐药机制研究提供了理论基础。

摘要：国内外临床实践和研究结果均证明细菌的耐药性、慢性感染疾病难以治愈和反复发作都与细菌的生物膜密切相关。生物膜顽固的黏附性和致密性对游离细菌的保护,使得细菌对抗生素的耐药性增加10~1000倍。基于群体行为控制的生物膜抑制剂开发有望提供解决思路,为此合成出9个具有生物膜抑制作用的化合物,并测试其生物膜抑制活性。研究发现在20μmol的抑制剂条件下,其中8个化合物均显示鲍曼不动杆菌的生物膜抑制活性,其中2个化合物在20μmol条件下生物膜抑制率超过60%,并且通过扫描电镜观察研究细菌在硅胶片表面的生长情况,在添加化合物6的硅胶片表面并未形成生物膜群落,而在未添加化合物的硅胶片表面形成了生物膜群落,进一步说明了合成化合物对生物膜的抑制作用。

摘要：目的体外斑点杂交实验模拟体内环境验证计算机辅助软件设计的反义寡核苷酸序列的活性。方法采用计算机辅助软件对多重耐药鲍曼不动杆菌生长必须基因gyrA的mRNA进行二级结构分析计算,设计出10条反义寡核苷酸序列,合成探针与体外转录并用地高辛标记的gyrA mRNA进行斑点杂交,分别选择一条杂交信号最强和一条杂交信号弱的探针序列合成连接穿膜肽序列的肽-肽核酸,以不同浓度的肽-肽核酸处理鲍曼不动杆菌标准株ATCC19606和多重耐药株,测定经不同浓度PPNA处理的细菌光密度A600值并进行平板菌落计数,观察其对细菌生长的抑制作用。以20μmol/L杂交信号强的肽-肽核酸作用于铜绿假单胞菌,测细菌光密度A600值,观察其对细菌生长的抑制作用。结果杂交信号强的肽-肽核酸对多重耐药的鲍曼不动杆菌和ATCC19606均有明显的体外抗菌活性,其最低抑菌浓度分别为5与10μmol/L,10μmol/L浓度时对两种细菌均具有杀菌活性,而杂交信号弱的肽-肽核酸对细菌的生长无抑制作用,即使将其浓度增加到20μmol/L。杂交信号强的肽-肽核酸对铜绿假单胞菌无生长抑制作用。结论体外斑点杂交实验能够验证计算机软件预测设计的具有特异性的反义核酸的活性,为体外可靠、快速、高通量筛选高效反义序列提供了一种有效的方法,并且为筛选所有基因高效反义序列搭建了一个平台。