摘要：【目的】鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)和滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)是对家禽危害最大的两种支原体,MG、MS的早期诊断是预防和控制禽支原体的关键环节。通过将重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)和测流层析试纸条(lateral flow dipstick,LFD)相结合,建立一种操作便捷、反应快速、结果可视化、可同时检测MG、MS两种病原的快速检测方法。【方法】基于MG的mgc2基因、MS的vlhA基因设计特异性引物和探针,优化反应时间、反应温度及引物配比建立双重LFD-RPA快速检测方法,评价其灵敏度、特异性、稳定性,同时对120份临床样品进行检测。【结果】双重LFD-RPA检测方法在37℃下反应5-10min即可完成扩增,其RPA-MG-F2/R2、RPA-MS-F1/R1最佳引物配比为0.6∶1.4。MG、MS的最低检出限分别为3.75 copies/μL、3.46 copies/μL。用该方法与OIE推荐的PCR方法对120份样品进行检测,二者符合率为93.3%。【结论】MG、MS双重LFD-RPA检测方法在恒温条件下即可完成扩增,其操作简单、反应快速、灵敏度高、特异性强、稳定性好,无需使用任何仪器即可观察到结果,适用于基层MG、MS单独感染或混合感染的现场快速检测。

摘要：根据ERNascimento等从鸡毒支原体(Mycoplasmagallisepricum,MG)基因文库分离的种特异性片段fMG2序列,设计合成一对长25bp的引物L1R1,经PCR反应条件优化选择,对5株MGDNA扩增均产生出预期的732bp特异扩增片断,而不能扩增滑液支原体(Mycoplasmasynoviae,MS)、Ecoli、PUC19质粒DNA,符合设计要求;DIG随机引物法标记扩增产物制成DNA探针,与上述菌株DNADotblot杂交,MG呈阳性,其它为阴性;将扩增产物克隆于pGEMT载体,经EcoRI和RsaI酶切,证实克隆片段与目的DNA大小及酶切位点相同;测序结果表明扩增片段与fMG-2靶序列同源性达972%,与已发表的DNA序列无明显同源性。说明所建PCR方法种特异性强,特异扩增片段克隆成功。

摘要：为建立一种能鉴别鸡毒支原体强弱毒株的快速检测方法,根据GenBank中鸡毒支原体S6株的16SrRNA基因序列和F弱毒疫苗株假定的α磷酸海藻糖酶基因序列,设计2套环介导等温扩增引物,建立了鸡毒支原体强弱毒株的环介导等温扩增可视化鉴别检测方法。该方法的敏感性可达10fg,是常规PCR方法的100倍,对其他鸡常见病原体的检测结果均为阴性。全部反应只需一个可控温的水浴锅在1h内即可完成,通过肉眼观察颜色直接判定结果。本研究建立的环介导等温扩增方法简便、快速、灵敏、特异,是一种适于基层工作站的鸡毒支原体强、弱毒株鉴别检测方法。

摘要：根据已发表的鸡毒支原体种特异性序列fMG-2设计1对引物,建立检测鸡毒支原体的PCR方法。该法对鸡毒支原体能特异性扩增726 bp的目的片段,而对其他禽病原DNA模板的扩增结果为阴性。建立的PCR方法对鸡毒支原体的最少检出量为3 pg。用建立的PCR方法对临床采集的样品进行检测,同时对相应的样品进行细菌分离,结果临床样品PCR的阳性检出率为20.5%,细菌分离培养的阳性率为0.9%,表明PCR的敏感性高于细菌分离鉴定。

摘要：为建立鸡毒支原体(MG)的快速定量检测方法,本研究根据GenBank中登录的MG 16S rDNA基因序列设计了一对引物,以MG基因组DNA为模板扩增其16S rDNA基因片段,并克隆于pMD18-T载体中,以纯化的重组质粒作为标准品建立了MG SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法。结果表明,该方法在1.96×10~8拷贝/μL^1.96×10~2拷贝/μL范围内线性关系良好,相关系数为0.999;最低检测限可达1.96×10~1拷贝/μL;与禽类其它呼吸道病原无交叉反应,特异性良好;批内及批间变异系数均低于2%,具有较高的重复性和稳定性。采用该方法抽检30份疑似临床样品,检出率为40%,敏感性明显高于常规PCR(33%)和血清平板凝集试验方法(23%),检测活疫苗可达到精确定量每头份2.0×10~7拷贝/μL。该研究为MG的早期诊断与净化、疫苗质量监测提供了一种新的快速定量检测技术。

摘要：为了探明醛缩酶在支原体中的定位,根据已发表的鸡毒支原体醛缩酶(fba)基因序列设计特异性的引物,以鸡毒支原体Rlow株基因组为模板,通过Overlap PCR点突变扩增鸡毒支原体醛缩酶fba基因,将fba克隆至pET-28a(+)载体后进行序列测定和分析。结果表明,fba基因全长873bp,编码290个氨基酸。将构建的重组表达质粒pET28a-fba转化至大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下成功获得表达融合蛋白rMGfba,大小约为33ku。纯化蛋白并对蛋白进行酶活性检测,结果显示该酶在体外具有与阳性对照醛缩酶相同的催化功能。用该蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,提取鸡毒支原体膜蛋白,Western-blot分析结果显示FBA多抗可与疏水性膜蛋白特异性结合,说明FBA位于鸡毒支原体膜表面。

摘要：为建立一种能鉴别鸡毒支原体(MG)强、弱毒株的快速检测方法,本研究根据GenBank中MG强毒株和弱毒株的基因组序列,选取特异性保守区序列设计了2对引物和2条探针,分别用于强弱毒株和弱毒株的检测,优化反应条件,建立了能区分MG强、弱毒株的荧光定量PCR检测方法。该法特异性强,对鸡常见呼吸道病原体的反应均为阴性;灵敏度高,可检测到100拷贝/μL的模板;稳定性好,批内和批间试验Ct值的变异系数小。本研究建立的MG强、弱毒鉴别检测方法简便、快捷,为该病的防控与净化提供新方法、新思路。

摘要：针对由于鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)不同毒株(针对TS-11、6/85、F株疫苗株和S6、R株野毒株)的特定序列,设计出特异性检测引物,对临床免疫MG疫苗株TS-11的鸡群以及父母代(A^H场)鸡群和祖代(I场)鸡群采集毛蛋气囊拭子,A场父母代种鸡群和I场祖代鸡群同时采集咽喉拭子进行MG的PCR鉴别诊断,对临床送检免疫6/85的客户鸡群(J场)采集病料,F株疫苗株进行MG的鉴别诊断,同时采集SPF鸡群咽喉拭子作为阴性对照群,验证该鉴别引物的特异性。结果显示:鉴别引物具有非常好的特异性,SPF鸡群MG的检测均为阴性,不存在假阳性的弊端;临床免疫MG疫苗株6/85的鸡群(J场)存在MG野毒株S6的感染,在免疫后1个月左右采集病料中仍能检出MG 6/85疫苗株。对免疫TS-11的父母代种鸡群(A^H场)和祖代种鸡群(I场)死亡的毛蛋气囊拭子,用PCR检测MG阳性率,结果显示:祖代鸡群(I场)后代死亡的毛蛋气囊评估结果为优,毛蛋气囊拭子MG的PCR鉴别引物检测均为阴性;而父母代鸡群后代死亡的毛蛋气囊从50周龄开始出现浑浊,MG的PCR鉴别引物可同时检出TS-11疫苗毒和野毒株,部分鸡群同时存在R株和S6株两种野毒感染;采集A场父母代种鸡群的咽喉拭子和后代啄壳死亡毛蛋气囊拭子,PCR检测结果显示种鸡群和后代可同时检出野毒株S6和疫苗株TS-11。这表明种鸡群MG的感染,可通过垂直传播感染其后代。本研究设计的MG鉴别引物,可将不同MG疫苗株(TS-11、F株、6/85)与野毒株(S6株、R株)区分,为临床MG的鉴别诊断和种鸡群的MG感染状态评估提供积极的指导意义。

摘要：鸡毒支原体(MG)和滑液囊支原体(MS)是对家禽危害最大的两种支原体,本研究拟建立基于重组酶聚合酶扩增技术(RPA)的MG、MS双重检测方法。以MG的mgc2基因、MS的vlhA基因为检测靶标设计数对引物,通过筛选得到最佳引物,优化反应时间和反应温度以确定最佳反应条件,通过优化MG、MS最佳引物配比确定双重基础RPA的反应体系,并进行灵敏度、特异性、重复性试验,用所建方法对120份临床样品进行检测。结果显示,建立的MG、MS双重基础RPA检测方法在37℃下反应20 min即可完成扩增,其最佳引物配比为0.6∶1.4。以重组质粒为模板时,MG、MS的最低检出限分别为3.75 copies/μL、3.46copies/μL;以基因组DNA为模板时,MG、MS的最低检出限分别为1.23×10^(-3)ng/μL、5.68×10^(-3)ng/μL。该方法具有良好的特异性和稳定性。分别用该方法与OIE推荐的单重PCR方法检测120份临床样品,结果表明,该方法的检出率高于OIE的PCR方法,与OIE的PCR方法一致性较强。上述结果表明,建立的MG、MS双重基础RPA检测方法具有操作简单、反应快速、灵敏度高、特异性强、稳定性好的优点,可实现临床MG、MS感染的鉴别诊断。

摘要：为了建立鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)套式PCR检测方法并初步将其应用于临床检测,对目前常用的5对引物(gapA-F/gapA-R、16SrRNA-F/16SrRNA-R、mgc2-F1/mgc2-R1、mgc2-F2/mgc2-R2、LP-F/LP-R)检测MG的灵敏度进行了比较,从中选出灵敏度较强的引物建立套式PCR检测方法,同时进行了特异性、敏感性及临床检测试验。结果表明,以mgc2基因设计的引物灵敏度最高,能检测出的MG的最低质量浓度为57.6pg/μL,用此引物建立的套式PCR能够扩增的基因片段的大小为300bp,与GenBank中收录的相关序列的同源性为98%,而与大肠杆菌、沙门菌、鸡滑液囊支原体均无交叉反应,能够检测出DNA的最小质量浓度为0.18fg/μL。通过对山东地区疑似MG的50只病死鸡进行检测,阳性检出率为80%。本研究建立的鸡毒支原体套式PCR具有敏感性高、特异性强等优点,可用于MG的临床诊断和分子流行病学调查。