摘要：本研究旨在通过构建重组质粒pEGFP-hTERT转染鸡胚胎干细胞(Chicken embryonic stem cells,cESCs),优化鸡胚胎干细胞培养体系,以期构建鸡胚胎干细胞株或细胞系。在获得hTERT基因后,构建重组质粒pEGFPhTERT,并利用FuGENE^(?)HD转染鸡成纤维细胞(DF-1),转染24 h后,荧光显微镜检测;再以80%BRL-CM(大鼠肝细胞条件培养基)与20%的ES基础培养液混合的条件培养基培养分离的cES:s,添加10μmol·L^(-1)维生素C,AKP染色以及相关表面抗原SSEA-1、SOX2和OCT4检测鉴定后,以G418筛选pEGFP-hTERT转染的cES:s,传代培养后荧光定量PCR检测相关干性基因的表达水平。结果表明:维生素C可以促进cESCs增殖,pEGFP—hTERT转染的DF-1细胞中可以检测到绿色荧光表达,pEGFP—hTERT转染的cESCs可持续传至10代以上,且仍保持未分化状态,干细胞表面特异性抗原检测呈阳性,且相关干性基因的表达水平差异不显著(P>0.05)。综上表明:pEGFP-hTERT转染的cESCs在80%BRL-CM结合外源因子的作用下,能够持续稳定传至10代且仍保持未分化状态,可应用于鸡胚胎干细胞的永生化和细胞系建立。

摘要：旨在探讨BMP4诱导鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化的作用机理。采用单层贴壁培养作为分化模式，分别采用10、20、30和40ng·mL-1 BMP4浓度诱导雄性鸡胚胎干细胞，通过形态学、荧光定量PCR和免疫细胞化学检测诱导效果。根据细胞形态变化和差异基因表达量变化，确定了BMP4的适宜诱导浓度为40ng·mL-1。在适宜浓度诱导过程中，诱导4d类胚体开始出现，6～8d类胚体逐渐增大，数量增多，10d部分类胚体开始散开，变为小的圆形细胞，12d在散开后的类胚体周围可观察到少量生殖样细胞，14d生殖样细胞数目增多，且呈聚团生长的趋势。诱导过程中相应基因表达量也发生变化：胚胎干细胞标记基因Nanog、Sox2表达量显著下降（P〈O．01），生殖细胞特异基因Stra8、Dazl、integrina6、c-kit表达量均呈显著上升趋势（P〈O．01）。BMP4可以引起生殖细胞相应基因的表达，促进雄性鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞方向分化，结果为雄性生殖细胞的体外诱导研究提供试验参考，为进一步研究雄性生殖细胞发生和调控机制提供理论基础。

摘要：文章探讨了卵泡刺激素(FSH)诱导鸡胚胎干细胞(ESCs)向雄性生殖细胞分化的作用效果。首先对FSH的适宜诱导浓度进行筛选,再将传至2代的ESCs,在RA和支持细胞诱导的基础上添加适宜浓度的FSH进行诱导,通过形态学观察、实时荧光定量PCR及免疫细胞化学对诱导结果进行检测。筛选出适宜的FSH浓度为25 ng/mL。单独使用FSH诱导,未出现类SSCs样细胞;FSH与支持细胞诱导至第6天出现类胚体,至第12天,出现少量精原样细胞;FSH联合支持细胞和维甲酸(RA)进行诱导,至第2天出现类胚体,第12天出现类SSC样细胞。实时荧光定量PCR结果显示,FSH+支持细胞组、FSH+支持细胞+RA组中,Stra8、integrinβ1、Dazl表达量都持续上调,ESCs标记基因Nanog、Sox2表达量均呈持续下调趋势。添加FSH的诱导组中Stra8的表达量相对于各对照组上调显著。FSH单独诱导不能引起ESCs向雄性生殖细胞分化,但具有促进支持细胞和RA诱导ESCs向雄性生殖细胞分化的作用效果,该结果为进一步研究雄性生殖细胞的形成和调控机制提供理论基础。

摘要：试验旨在探讨睾酮对鸡胚胎干细胞(ESCs)向雄性生殖细胞分化过程中的诱导作用效果。首先对睾酮的适宜诱导浓度进行筛选,再联合支持细胞和维甲酸(RA)对传至2代的ESCs进行诱导,通过形态学观察、实时荧光定量PCR及免疫细胞化学对诱导结果进行检测。结果表明:单独使用睾酮诱导,未出现精原干细胞(SSCs)样细胞;睾酮与支持细胞联合诱导时,在第6天有少许类胚体出现,至第12天,有少量SSCs样细胞;睾酮联合支持细胞和RA诱导过程中,诱导第2天出现类胚体,诱导第12天后出现类SSCs样细胞。实时荧光定量PCR结果显示,睾酮+支持细胞组中,ESCs标记基因Nanog、Sox2表达量均呈持续下调趋势,Dazl、integrinβ1、Stra8表达量持续上调;睾酮+支持细胞+RA共同诱导组中,各标记基因与ESCs向生殖细胞分化过程中各基因表达的趋势一致,并且Dazl的表达量明显高于对照组。睾酮单独诱导不能使ESCs向雄性生殖细胞分化,但有促进支持细胞和RA诱导效果的作用,该结果为进一步研究雄性生殖细胞的形成和调控机制提供理论基础。

摘要：试验分别探讨了睾酮和FSH诱导鸡胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs)向雄性生殖细胞分化的作用效果。首先筛选睾酮和卵泡刺激素(FSH)的适宜诱导浓度,在RA和支持细胞的诱导基础上分别添加适宜浓度的睾酮和FSH对传至2代的ESCs进行诱导,通过形态学观察、实时荧光定量PCR及免疫细胞化学对诱导结果进行检测。结果显示:睾酮和FSH的适宜诱导浓度分别为15 ng/m L和25 ng/m L,单独使用睾酮和FSH诱导均未出现类SSCs样细胞;二者联合支持细胞和RA诱导,诱导2 d出现类胚体,随后类胚体体积逐渐变大,诱导12 d类胚体解体出现类SSC样细胞;实时荧光定量PCR结果显示,睾酮和FSH分别与支持细胞和RA共同诱导组中,Stra8表达量持续上调,integrinβ1、Dazl表达量显著上调,ESCs标记基因Nanog、Sox2表达量均呈持续下降趋势;睾酮的多因素诱导组中,Dazl的表达量明显高于RA和支持细胞诱导组;而FSH的多因素诱导组中Stra8的表达量相对于RA和支持细胞诱导组也显著升高。结果表明睾酮和FSH单独诱导不能引起ESCs向雄性生殖细胞分化,但可以促进支持细胞和RA诱导ESCs向雄性生殖细胞分化的作用效果,该结果为进一步研究雄性生殖细胞的形成和调控机制提供理论基础。

摘要：目的:探讨鸡胚胎干细胞(ESC)和精原干细胞(SSCs)在基因表达水平上的差异。方法:传至二代的ESC和SSCs,采用免疫荧光和碱性磷酸酶检测法联合鉴定其干细胞特性,RT-PCR方法检测两者相关基因的表达差异。结果:两种处于未分化状态时的干细胞基因表达存在差异:未分化的ESC表达基因GDF3基因和Nanog基因;SSCs表达特定基因c-kit、Cvh和Stra8基因。结论:两种干细胞在基因表达水平上有差异,为ESC与SSCs在基因水平上的鉴定提供参考依据。