摘要：根据鸡贫血病毒(CAV)的基因序列,选取一段高度保守的基因序列作为目的片段设计引物与探针,将该目的片段克隆到pMD18-T载体中,作为阳性标准品。通过优化荧光定量PCR反应条件,建立了CAV的荧光定量PCR检测方法。结果表明,该检测方法的敏感性达到10个病毒拷贝/μL,与其他禽病病毒无交叉反应,批间与批内重复试验相关系数都小于5%。实验数据证明该检测方法敏感性高,特异性好,重复性佳。

摘要：根据鸡贫血病毒Cux_1株基因组序列设计了一对引物,通过PCR扩增出VP1基因。将扩增出的片段克隆到pGM_T载体上,通过测序分析证实该片段与鸡贫血病毒Cux_1株的VP1基因序列一致。然后将克隆化VP1基因亚克隆到PET_32a(+)载体上并进行原核表达。SDS_PAGE和Western Blot分析表明,一个分子质量为70.4 kDa的重组蛋白获得了成功表达,并且鸡贫血病毒阳性血清能和重组蛋白发生反应。

摘要：根据GenBank上已发表的鸡贫血病毒Cux-1株基因组序列设计并合成了1对特异性引物,通过PCR扩增出vp2基因,将扩增出的片段克隆到pGM-T载体上,通过测序分析证实该片段与鸡贫血病毒Cux-1株的vp2基因序列一致。将克隆的vp2基因亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)上并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达,表达的融合蛋白进行SDS-PAGE和Western blot分析,并用镍柱在天然状态下进行了纯化。结果表明,表达的融合蛋白分子量约为45ku,能与鸡贫血病毒阳性血清发生反应。

摘要：在已构建鸡贫血病毒 (CAV)全基因组体外克隆 (pCAV2 4)的基础上 ,设计一对特定引物 ,用PCR定向点突变方法扩增出含有完整的EcoRI位点的CAV全基因组 (2 3kb) ,并克隆入pUC18载体中 ,获得阳性克隆 ,命名为pCAVE+ 。经酶切鉴定和序列分析EcoRI位点两侧序列 ,原先不完整的EcoRI位点 ( GACTTC )已被定向点突变为完整的EcoRI位点 ( GAATTC )。对重组质粒pCAVE+ 以EcoRI酶切回收CAV全基因组DNA ,在体外连接并经纯化后 ,经Effectene转染易感宿主细胞MSB1。将转染细胞培养上清连续传代 8次以后 ,出现病毒复制 (MSB1细胞培养基颜色不再变黄 )。取此时细胞培养液感染无CAV的 1日龄SPF小鸡 ,14天出现典型的鸡贫血症状和胸腺萎缩、骨髓脂肪变性等病变。获得了能在体外自主复制并组装成完整CAV病毒子的感染性核酸。

摘要：目的:为了寻找肿瘤特异凋亡蛋白,克隆鸡法氏囊组织中鸡贫血病毒Apoptin蛋白的编码基因并进行序列分析.方法:根据基因数据库资料设计合成引物,以成鸡法氏囊组织中提取的DNA作模板,通过PCR获得了特异扩增产物,将其插入到pGEMT-easy载体并转染感受态***-DH5α菌株,提取质粒经限制性内切酶酶切鉴定后,使用DNA测序仪测定插入片段的DNA序列.使用DNAsis分析软件分析所克隆的DNA序列及其编码蛋白质,并与数据库中Apoptin蛋白的编码基因相比较.结果:序列分析表明,成功地克隆了鸡贫血病毒的Apoptin基因,同基因数据库中的相关资料比较发现与山东报道的Apoptin基因(GenBank AY171617)的核酸序列一致,同鸡贫血病毒全基因序列中的Apoptin序列(GenBank AF313470)有6个核酸差异.结论:Apoptin编码基因的克隆为特异诱导肿瘤细胞凋亡治疗肿瘤奠定了基础.

摘要：目的利用凋亡素和IL18基因的抗肿瘤优势,设计构建共表达凋亡素和hIL-18基因的真核重组子,检测其在体外对人肝癌细胞BEL7402的作用效果,旨在探索新的肿瘤基因治疗方法。方法将凋亡素VP3基因与hIL-18基因一同克隆到真核表达载体pVAX1上,构建重组质粒pVVP3IL-18,经脂质体介导,转染人肝癌细胞BEL7402,AO/EB染色,末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)法和流式细胞仪分别分析凋亡细胞的形态学变化、DNA断裂情况和不同细胞周期的DNA含量变化,透射电镜分析凋亡细胞超微结构变化。结果随着转染时间的延长,重组质粒pVVP3IL18所表达的目的蛋白对BEL7402细胞的杀伤作用逐渐增强,作用48h,形态学观察表明BEL7402细胞发生明显的凋亡,凋亡率可达(56.5±11.9)%,并且大部分细胞为TUNEL阳性着色,流式细胞术分析可见明显的亚二倍体凋亡峰,透射电镜观察可见细胞核固缩、染色质聚集等典型的凋亡超微结构变化。结论联合应用凋亡素与hIL18基因,在体外对人肝癌细胞BEL7402具有明显的凋亡诱导作用。

摘要：目的获得来源于浙江地区鸡组织中的鸡贫血病毒（CAV）筇基因并分析其变异情况。方法根据GenBank登录的vp3序列设计特异引物，利用PCR方法从鸡组织中获得7个CAV的硪，基因克隆，将其克隆到载体进行测序。结果40份鸡血清中共检出CAV阳性16份，阳性率40．0％。序列测定结果表明，叼妇基因长366bp，编码121个氨基酸，与GenBank登录的其他毒株目妒基因的核苷酸序列同源性为97．O％。100．0％，氨基酸序列同源性为95．0％-100．0％。结论通过PCR方法扩增获得了CAVvp3基因，w3基因及VP3蛋白总体上非常保守。

摘要：根据GenBank中CAV哈尔滨分离株基因序列,设计出针对CAV VP1大片段(608 bp)的引物,利用PCR方法从CAV基因纽序列中扩增出VP1基因的大片段(608 bp),按照正确的读码框克隆到原核表达载体pET32a(+)上,得到含VP1大片段的pET32a(+)重组子,转化大肠埃希菌BL2l(DE3)感受态细胞,IPTG诱导重组蛋白表达,经SDS-PAGE和Western blotting检测发现有分子质量约42 ku的融合蛋白表达,与预期分子质量大小一致,通过Ni亲和层析柱纯化出融合蛋白,经Western blotting鉴定,融合蛋白与His单抗能够结合。CAV VP1基因的克隆表达及其融合蛋白的纯化为后续制备多克隆抗体和单克隆抗体提供了良好的抗原来源,也为研究VP1与其他CAV蛋白之间的相互关系奠定了基础。

摘要：1材料与方法参照GenBank中CAV病毒Cux-1标准株的基因组序列,应用Primer5.0软件设计1对引物,其上下游引物中分别含有EcoRl和Xholl酶切位点。预期扩增长度为396bp。本试验采用由上海博亚生物技术有限公司合成的如下特异性引物。