摘要：【目的】探究鸭坦布苏病毒(Duck Tambusu virus,DTMUV) E蛋白全长及其结构域I、II和III (DI、DII和DIII)对鸭胚成纤维细胞(Duck embryo fibroblast,DEF)的细胞周期与凋亡的影响。【方法】本研究设计、合成DTMUV E蛋白全长及其DI、DII和DIII真核表达质粒,并转染至DEF,用流式细胞仪检测不同蛋白引起的DEF细胞凋亡和细胞周期的变化。【结果】细胞凋亡结果显示:质粒转染细胞24 h后,E蛋白全长及DI、DII、DIII诱导的DEF早期凋亡率分别是16.4%、15.1%、14.0%和17.2%;质粒转染细胞36 h后,E蛋白全长及DI、DII、DIII诱导的DEF早期凋亡率分别是23.4%、18.5%、26.7%和29.4%。细胞周期检测结果显示:E蛋白全长及DI、DII、DIII的质粒转染细胞24、36 h后,DNA合成期(S期)细胞比例都明显高于pEGFP-N1空载体转染组。质粒转染24 h后,E蛋白及DI、DII、DIII的S期细胞比例分别为5.43%、22.58%、12.75%和12.80%;质粒转染细胞36 h后,E蛋白及DI、DII、DIII的S期细胞比例分别为9.98%、11.44%、10.44%和11.00%。【结论】DTMUV E蛋白全长及其3个结构域均能诱导早期细胞凋亡,引起细胞S期的停滞,但是各蛋白片段诱导细胞凋亡和引起细胞周期变化的能力存在一定差异。

摘要：【目的】建立能同时检测新型鸭呼肠孤病毒(New-type duck reovirus,NDRV)、新型鹅细小病毒(Novel goose parvovirus,NGPV)和鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)的方法。【方法】根据NDRV、NGPV和DTMUV基因组的保守区域设计3对特异性引物,预期特异性扩增NDRV、NGPV和DTMUV的片段大小分别为594、467、328 bp,建立可同时检测NDRV、NGPV和DTMUV的多重PCR检测方法,对其进行特异性、敏感性及重复性检验,并在临床上进行初步应用。【结果】特异性检测结果表明,该多重PCR方法可同时扩增NDRV、NGPV、DTMUV的目的片段,且未扩增出其他鸭常见病原;敏感性结果显示NDRV、NGPV和DTMUV的检测下限分别为8.80×10^(4)、4.03×10^(4)、2.15×10^(4)copies·μL^(−1);重复性试验表明该方法具有良好的重复性。采用建立的多重PCR方法对167份临床样品进行检测结果显示,其检测结果与该3种病毒的常规单一PCR检测结果符合率为100%。【结论】建立的多重PCR检测方法具有特异性强、敏感性高、重复性好等优点,适用于临床样品中存在以上3种病原感染的检测和流行病学调查。

摘要：设计分别检测鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus,DTMUV)、鸭瘟病毒(duck plague virus,DPV)和鸭疫里默杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)的特异性引物,且PCR产物大小差异明显;优化多重PCR的引物浓度、退火温度,并分析特异性和敏感性;利用多重PCR方法和单一PCR方法对54份临床采集的鸭源病料进行检测。结果显示,该多重PCR检测方法可用于DTMUV、RA和DPV的单纯或混合感染的诊断,PCR产物大小分别为220,308,551 bp;反应体系中最佳引物终浓度组合为1.0μmol/L的引物DTMUV-S和DTMUV-A、0.5μmol/L的引物RA-S和RA-A、0.5μmol/L的引物DPV-S和DPV-A;该检测方法退火温度在46.5~63.8℃之间均可以检测到3种病原体核酸,其中最佳退火温度为57.0℃。该方法检测DTMUV、DPV和RA的核酸最低量分别为6.570,0.600,0.440μg/L。临床样品检测结果显示,本试验建立的DTMUV、DPV和RA多重PCR检测结果与单一PCR检测结果符合率为98.1%。结果表明,本试验建立的复合PCR方法可适用于3种病原体单纯或混合感染的快速诊断,为流行病学调查及快速、准确制定针对性防控措施提供了技术支持。

摘要：为建立检测鸭坦布苏病毒(DTMUV)的荧光逆转录环介导等温扩增(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)检测方法,根据DTMUV NS5基因保守序列设计1套特异性引物,对反应时间和温度进行优化,并评价该方法的特异性、敏感性、重复性和临床适用性。结果显示:建立的荧光RT-LAMP最优反应条件为65℃25 min;只特异性扩增DTMUV,而不扩增其他几种禽类病毒;最低检测限为4×10^(2)copies/μL,与qRT-PCR方法敏感性一致,是普通RT-PCR的100倍;批内和批间重复性高;应用该方法检测DTMUV不同剂量人工感染鸭肝脏样品,对接毒剂量为10^(3-7)TCID_(50)和10^(2-7)TCID_(50)组的阳性检出率均为100%,对接毒量10^(1.7)TCID_(50)组的阳性检出率为90%(9/10)。结果表明,本研究建立的荧光RT-LAMP检测方法特异性强、重复性好、敏感性高,可成为快速诊断DTMUV的方法之一。

摘要：为获得鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus,DTMUV)E蛋白膜外区的表达产物,以DTMUV安徽分离株(AH10)E基因序列设计特异性引物,扩增E基因,将其克隆至原核表达载体pET-SUMO中,构建重组表达质粒pET-SUMO-E,然后将其转化至感受态细胞*** Rosetta(DE3)中,并以IPTG诱导表达。经SDS-PAGE检测,获得了70ku的表达产物,与预期结果相符。Western-blot分析表明,目的蛋白能与兔抗DTMUV E蛋白多克隆血清及DTMUV鸭阳性血清发生特异性反应,显示出良好的反应活性。结果表明,成功表达了E蛋白膜外区,这一成果为DTMUV疫苗制备和诊断试剂盒的研发奠定了基础。

摘要：根据鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)ZJ-407株全基因组序列设计并合成4对特异的Infusion引物,应用RT-PCR技术分4段扩增了DTMUV全基因组c DNA。通过In-fusion技术将扩增的c DNA重叠片段A,B,C和D片段分别克隆到载体p BluescriptⅡKS(+)中,获得了DTMUV全长基因组c DNA克隆p SK-T7-DTMUV。在扩增5'末端时,引入T7启动子序列;在基因组3'末段引入SmaⅠ酶切位点,以供c DNA模板的线性化之用。核酸序列分析表明,DTMUV毒株基因组全长为10 990个核苷酸,与DTMUV ZJ-407 DF-1细胞分离株的同源性为99.9%;全长基因组中有9个核苷酸发生突变,其中7处为沉默突变,2处导致相对应的氨基酸发生改变,且这两处均位于非结构蛋白NS5。结果表明,本研究成功构建了DTMUV ZJ-407株基因组全长c DNA,为其感染性c DNA的拯救奠定基础。

摘要：根据鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DFV)NS5基因序列特征设计引物,建立基于SYBR GreenⅠ检测模式的实时荧光定量RT-PCR(real-time RT-PCR,RRT-PCR),该方法检测DFV NS5基因2.74×103～2.74×107拷贝/μL反应范围内有很好的线性关系。扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体,Tm值为(86.23±0.18)℃,对禽流感病毒、鸭肝炎病毒、鸭源禽1型副黏病毒、鸭减蛋综合征病毒、番鸭呼肠孤病毒核酸均无阳性信号扩增,可重复性好,组内变异系数为0.52%～1.48%,组间变异系数0.71%～2.21%。检测速度快,从样本处理到报告结果仅需4h。

摘要：为提高鸭坦布苏病毒(DTMUV)TaqMan荧光定量PCR方法的敏感性和简化反应条件,本研究在前期建立的TaqMan荧光定量PCR方法的基础上,设计一条特异性的反转录引物,优化反应体系,建立了简便、快速、敏感的TaqMan荧光定量PCR方法。该荧光定量PCR方法最低检测限为10拷贝,敏感性是未优化的荧光定量PCR方法的5倍、是普通PCR方法的100倍,并且该方法对DTMUV的最低检测限是0.01半数鸡胚致死量(ELD50)。通过批内和批间实验的变异系数表明优化的荧光定量PCR方法的重复性比未优化的荧光定量PCR方法好。通过该优化的荧光定量PCR方法检测其它常见的鸭病病毒的DNAs或RNAs,证明了该方法特异性好。对现地60份疑似DTMUV的样品进行检测,用该方法检出57份样品为阳性,明显高于普通PCR,并且在区分35Ct值左右样品试验中敏感性优于未优化的荧光定量PCR方法。该优化的DTMUV TaqMan荧光定量PCR方法更适用于DTMUV的快速定量流行病学诊断。

摘要：本试验旨在建立一种同时快速检测鸭坦布苏病毒(DTMUV)和所有亚型禽流感病毒(AIV),且可同时进行H9亚型AIV分型检测的多重PCR检测方法。针对Gen Bank中DTMUV NS2基因、所有亚型AIV的M基因和H9亚型AIV的HA基因的保守序列,分别设计了3对特异性引物,建立了DTMUV和AIV多重PCR检测方法。该方法对混有H9亚型AIV和DTMUV的模板进行PCR扩增,得到了3个大小与试验设计相符的特异性扩增条带,对其他鸭病病原体进行PCR扩增,结果均为阴性。敏感性测定结果表明,该方法能检测到45 pg的DTMUV、7.6 pg的H9亚型AIV和76 pg的M基因。研究建立的多重PCR检测方法,具有快速、敏感、特异等优点,适用于临床检测的应用。

摘要：本试验旨在建立同时检测鸭坦布苏病毒(DTMUV)和鸭瘟病毒(DPV)的二重荧光定量RT-PCR方法。针对GenBank中DTMUVE基因和DPVUL6基因的保守序列,设计合成了2对引物和2条TaqMan探针。通过优化反应体系、条件及评价其特异性、敏感性,建立了检测DTMUV和DPV的二重荧光定量RT-PCR方法。该方法对DTMUV和DPV的检测灵敏度均达100个模板拷贝数,同时该方法对鸭源新城疫病毒、鸭肝炎病毒、番鸭细小病毒、H9亚型禽流感病毒和减蛋综合征病毒的检测结果均为阴性。本研究建立的DTMUV和DPV二重荧光定量RT-PCR具有敏感、快速、特异、定量、重复性好等优点,可用于DTMUV和DPV感染的快速鉴别诊断。