摘要：根据鹅星状病毒(GAstV)ORF1b基因与鹅源新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)σC基因的保守序列设计特异性引物,建立GAstV与NDRV双重RT-PCR检测方法,该方法具有较高的特异性,在903 bp(GAstV)和226 bp(NDRV)可检测到特异性条带,最低灵敏度为1.0×10^(3)copies/μL。在鲁中、鲁西北及鲁南地区不同规模的养鹅场中随机采取320份样本,GAstV的阳性率为21.56%(69/320),NDRV的阳性率为3.44%(11/320),混合感染阳性率为2.81%(9/320),单一RT-PCR结果与双重RT-PCR方法一致。该方法的建立为快速诊断GAstV和NDRV提供了可靠的手段。

摘要：【目的】了解鹅星状病毒(Goose astrovirus, GAstV)在广东部分地区的流行及遗传变异情况,阐明其遗传进化与全基因组的特征,为GAstV的防控提供理论基础。【方法】使用GAstV特异性引物对2021―2022年广东地区养鹅场内出现疑似痛风的36份鹅病料进行PCR检测,选取4份具有代表性的GAstV强阳性样品,利用鹅细小病毒、坦布苏病毒、禽流感病毒、新城疫病毒的特异性引物进行检测,以排除病料中存在其他常见的外源性病毒;在此基础上利用鹅胚及鸡肝癌细胞系(leghorn male hepatoma, LMH)对4份GAstV样品进行病毒的分离和纯化,使用透射电镜对病毒粒子的形态进行观察;设计7对特异性引物对4株GAstV进行全基因组扩增和测序,运用DNAStar软件对序列进行整理与拼接以获取GAstV的全基因组序列,利用MegAlign软件进行核苷酸相似性比对,并对关键氨基酸位点的变异情况进行分析,应用Mega-X软件对全基因及单个ORF基因(ORF1a、ORF1b、ORF2)进行系统进化树构建。【结果】经PCR鉴定发现被检样品中共有30份是GAstV阳性,选取的4份代表性GAstV阳性样品均不存在其他外源性病毒感染,利用鹅胚及LMH细胞成功分离出了该4株GAstV病毒,并获得了4株全长均为7 131 bp的GAstV基因组序列,包括18 bp的5′-UTR和184 bp的3′-UTR、3个阅读开放框(ORF1a、ORF1b和ORF2基因),其中ORF1a、ORF1b和ORF2基因分别长3 255、1 551和2 115 bp,与报道的GAstV全基因组特征基本一致。相似性分析显示,4株GAstV之间的核苷酸相似性在99.4%~99.8%之间,与GenBank收录的其他19株GAstV的核苷酸相似在57.6%~99.6%之间。全基因组及3个ORF基因的遗传进化分析显示,获得的4株GAstV均属于GAstV-Ⅱ型。氨基酸序列分析显示,4株GAstV的氨基酸存在22处位置上的突变,其中ORF1a基因有8处突变,ORF2基因有14处突变。【结论】分离的4株GAstV均为GAstV-Ⅱ型毒株,与中国其他地区流行的基因型基本一致,该4株病毒的氨基酸突变主要发生在ORF1a和ORF2区域,为后续疫苗研发、流行病学调查及致病机理等方面提供参考依据。

摘要：为建立一种可同时检测鹅星状病毒(GoAstV)、鹅细小病毒(GPV)和鹅坦布苏病毒(TMUV)的方法,根据GenBank上公布的GoAstV、GPV和TMUV的保守基因序列设计3对特异性引物,通过优化反应条件和反应体系,建立了能够同时检测GoAstV、GPV和TMUV的三重PCR方法,并初步应用于临床。结果显示:所建立的三重PCR检测方法能特异性扩增GoAstV、GPV和TMUV三种病毒的目的片段,对鹅副黏病毒、禽流感病毒、禽腺病毒和鹅圆环病毒的检测结果均为阴性,对GoAstV、GPV和TMUV的最低检出浓度分别为1.26×10^(5)、1.26×10^(3)和1.26×10^(5)copies/μL。利用三重PCR和单项PCR方法同时对黑龙江省部分鹅场的32份临床样品进行检测,3种病毒的阳性检出率分别为56.25%、6.25%和6.25%,2种方法的检测结果一致。结果表明,本试验中建立的三重PCR检测方法快捷、敏感、特异,能够用于GoAstV、GPV和TMUV的流行病学调查和临床检测。

摘要：为快速鉴别诊断鹅星状病毒(GoAstV)和鹅坦布苏病毒(TMUV),本研究根据GenBank上公布的GoAstV和TMUV基因保守区设计了2对特异性引物,结合金纳米材料,通过对反应条件的优化,建立了一种可同时检测这两种病毒的双重nano-PCR诊断方法。结果显示,该方法对鹅细小病毒(GPV)、鹅圆环病毒(GoCV)、新城疫病毒(NDV)和禽腺病毒(FAdV)这4种鹅常见病毒的扩增结果均为阴性。该方法对GoAstV和TMUV的最低检测浓度分别为1.21×10^(1) copies/μL和1.21×10^(3) copies/μL,敏感性较普通PCR分别高100倍和10倍。对42份临床样品的检测结果显示,共检出GoAstV 13份,TMUV 1份。上述结果表明,本研究建立的双重nano-PCR方法快速、特异、敏感,可用于鹅星状病毒和鹅坦布苏病毒的临床检测和流行病学调查。

摘要：为建立快速检测鹅星状病毒(GAstV)的方法,本研究根据GenBank中GAstV ORF2基因序列设计1对特异性引物,构建重组质粒pMD19-T-GAstV,以其作为标准品建立了GAstV的SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法。优化其反应条件及体系,进行特异性、敏感性和重复性试验以及临床样本检测。试验结果显示,除GAstV外,禽白血病病毒(ALV)、血清4型禽腺病毒(FAdV-4)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)和鸡传染性贫血病病毒(CIAV)等常见禽病病原利用该方法检测均呈阴性,表明其特异性良好;建立的荧光定量RT-PCR检出的最低模板含量为1μl 3.75×101拷贝,敏感性较高;组内和组间重复性试验变异系数均小于1%。利用该方法对来自安徽地区的32份临床样品进行检测,阳性检出率为43.75%,常规PCR方法阳性检出率为18.75%,阳性检出符合率100%,表明该方法可用于临床样品检测。该方法的建立为临床样品中GAstV的快速高效检测提供了技术支持。

摘要：鹅星状病毒是一种新发的可导致雏鹅以痛风为主要特征的传染性病原。为建立鹅星状病毒(AstV)的快速检测方法,本研究根据鹅Ast V ORF1b基因的保守序列设计了一组特异性的LAMP引物,建立鹅AstV的LAMP快速检测方法,并检测其特异性和灵敏度。结果显示:建立的LAMP方法的最佳反应温度为64℃;仅能扩增鹅Ast V,而对鹅细小病毒、鹅副黏病毒、鸭坦布苏病毒及鹅源H9N2亚型禽流感病毒均不能扩增;能够检测到的最低模板(cDNA)浓度为1 ng/μL,因此该方法具有较好的特异性和敏感性。临床样品检测结果显示:建立的LAMP方法与RT-PCR方法阳性符合率为95.65%。综上,本研究建立的LAMP方法能够特异、快速地检测新发鹅Ast V,为养殖基地、科研和检验检疫部门提供了一种快速检测该病原的技术手段。

摘要：为快速鉴别诊断鹅星状病毒(GoAstV)和鹅细小病毒(GPV),根据GoAstV和GPV基因序列保守区域设计了两对特异性引物,通过PCR扩增目的片段并构建重组质粒,建立了一种可同时检测这两种病毒的PCR诊断方法。该方法能够特异性扩增出两种病毒的相应片段,而对鹅副粘病毒(GPMV)、鹅流感病毒(GAIV)、鹅腺病毒(GADV)、鹅圆环病毒(GoCV)均无扩增,对重组质粒的最低检测拷贝数分别为1.25×10^(3) copies和1.25×10^(5) copies。应用该方法对50份鹅临床脏器样品进行检测,结果检测出GoAstV 35份、GPV 2份,GoAstV和GPV混合感染2份。结果表明,研究建立的双重PCR检测方法快速、特异、敏感,可用于GoAstV和GPV的流行病学调查和疾病监测。

摘要：为建立一种鉴定鹅星状病毒(GAstV)的RT-PCR方法,试验根据GenBank中GAstV ORF1b基因序列设计1对特异性引物,构建重组质粒pMD18-T-GAstV,以其作为标准品建立GAstV的RT-PCR检测方法。通过对GAstV及其他4种病毒进行检测,优化其反应条件并进行特异性、敏感性和重复性试验以及临床样本检测。结果显示,除GAstV外,鹅细小病毒(GPV)、鸭呼肠孤病毒(DRV)、鸡病毒性关节炎(AVAV)、坦布苏病毒(TmuV)等常见禽病病原利用该方法检测均呈阴性,表明其特异性良好;建立的RT-PCR检测方法的最低检出限可达5.5×103,敏感性较高;重复性试验显示其重复性良好。利用该方法对10份人工模拟病料进行检测限LOD分析,阳性样品10倍系列稀释浓度。结果表明,最低检出限可达1.21×103copies/μL。研究表明,成功建立了一种鉴定GAstV的RT-PCR方法,且该方法具有快速、廉价、特异性强、敏感性高和重复性好的优点,可用于GAstV的临床诊断。

摘要：鹅星状病毒(GAstV)是近年临床新发病原,也是导致当前雏鹅痛风致死的主要病因,研究显示该病毒存在两种不同基因型。为建立快速准确的核酸鉴别诊断方法,本研究针对不同基因型GAstV保守域RNA依赖性RNA聚合酶序列各设计1对特异性引物,建立以RNA为模板的双重一步法RT-PCR检测方法。条件优化试验结果显示,双重RT-PCR方法彼此无干扰;引物特异性强,对坦布苏病毒、鹅细小病毒、呼肠孤病毒、鸭瘟病毒的检测均为阴性;体系中引物适宜浓度为1μmol,退火温度范围广,50~54℃皆可;敏感性高,最低检测限分别为103拷贝数和102拷贝数。对采集自江浙地区的73份样品进行检测,结果显示,鹅星状病毒阳性率为93.2%,主要为Ⅱ型星状病毒的单一感染(阳性率86.3%),部分样品呈现两种类型星状病毒混合感染现象(阳性率6.8%)。上述结果表明本研究建立的双重RT-PCR方法可用于GAstV的鉴别诊断和分子流行病学调查。

摘要：为了建立一种能快速检测鹅星状病毒(GoAstV)、鹅圆环病毒(GoCV)、鹅细小病毒(GPV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)的多重PCR检测方法,本研究根据GenBank数据库已公布的GoAstV的ORF2基因、GoCV的Rep基因、GPV的VP3基因及DTMUV的NS5基因序列,分别设计4对特异性扩增引物,通过对扩增条件的优化及特异性、灵敏性的检验,建立了可同时检测以上4种病原的多重PCR检测方法,并对40份临床样品进行检测。结果显示,建立的多重PCR检测方法具有良好的特异性和较高的灵敏性,可同时扩增出大小为731 bp(GoAstV)、543 bp(GoCV)、392 bp(GPV)、200 bp(DTMUV)的特异性片段,且利用本试验建立的多重PCR检测方法对水禽其他病原体进行扩增均呈阴性。该方法对GoAstV、GoCV、GPV及DTMUV最低检出限度分别为4×10^(3),4.22×10^(3),4.43×10^(3),4.73×10^(3)copies/μL。单一PCR检测方法对临床病料样品检测结果与多重PCR检测结果一致,证明该方法可用于这4种病原临床病料样品的检测。