摘要：目的:建立一种快速、高效、简便的鹿茸、鹿角位点特异性聚合酶链式反应(PCR)鉴别方法。方法:通过比较梅花鹿、马鹿及其混伪品的COI,Cytb基因序列差异,根据Cytb片段上的3个SNP (single nucleotide polymorphism)变异位点设计出一对鹿茸的特异性鉴别引物LR-238上游和LR-238下游,并对影响PCR结果的主要因素退火温度,PCR循环次数,模板DNA浓度,Taq酶用量和及影响重复性的Taq酶种类和PCR仪型号等进行方法学考察和优化。结果:进行方法学考察确定最优鉴别条件的基础上,当PCR退火温度为56℃,循环次数为35次的条件下,鹿茸、鹿角正品均能扩增出约250 bp片段,其他9种混伪品麋鹿、白唇鹿、水鹿、坡鹿、黇鹿、骡鹿、驯鹿、驼鹿、狍及阴性对照无条带。不同来源的药用的马鹿亚种东北马鹿、塔河马鹿、天山马鹿、阿拉善马鹿、阿勒泰马鹿、新西兰马鹿,梅花鹿亚种东北梅花鹿、华南梅花鹿样品使用建立的位点特异性PCR鉴别方法均产生约250 bp特异性鉴别条带。结论:该文设计的鉴别引物具有高度的专属性,所建立的位点特异性PCR鉴别方法可用于鹿茸、鹿角的准确鉴别。

摘要：目的建立一种快速、准确和标准化的鹿茸饮片DNA条形码鉴别方法,并分析鹿茸药材原动物间的亲缘关系。方法通过下载GenBank鹿类动物线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因,经比对分析,在靠近COⅠ基因5′端设计了一对鹿科动物DNA条形码通用引物,对来源于鹿科动物3个属共计19份样本的鹿茸进行了PCR扩增和序列分析,并构建系统进化树。结果通过遗传距离和分子系统树分析显示DNA条形码鉴别方法能够在属水平和种水平将鹿科3属9种鹿成功的鉴别开来,对90%的鹿茸样本可进行有效地鉴定,而梅花鹿、马鹿中各一个样本未得到准确鉴定,具体原因有待进一步研究。结论所建立的鹿茸药材DNA条形码鉴别方法,准确可靠,可用于正品鹿茸马鹿和梅花鹿及其混伪品进行准确鉴定。

摘要：目的本实验对名贵中药材鹿茸的DNA指纹特征进行研究,从分子水平鉴定及分析鹿茸,研发鹿茸DNA检测试剂盒,并对其进行性能评价。方法以鹿茸细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(CoⅠ)和鹿茸线粒体细胞色素b(cytochrome b,Cyt b)为靶基因,采用生物信息学技术设计5对特异性引物,经实验筛选后确定细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ1,即mt DNA CoⅠ1(NC_013834.1)为特异性最好的引物,对鹿茸样品通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)进行扩增,优化PCR反应体系及反应条件,研发出鹿茸DNA检测试剂盒。对其性能进行评价,并对市售鹿茸样品进行检测。结果使用鹿茸DNA检测试剂盒提取的DNA纯度均在1.785~1.906内,该试剂盒的特异性体现在检测正品时出现条带,而伪品无条带;灵敏度达3.125 ng·μL-1;反复冻融5、10、15、20次后仍有效用;重复检测正、伪品3次,结果均一致;-20℃保存,有效期可长达1年。对5个地区12个市售样品进行质量分析,合格率为66.67%。结论研发的鹿茸DNA检测试剂盒特异性强、灵敏度高、稳定性及重复性均良好,操作简单,检测样品微量,适用范围广,成本低廉,结果准确,可为中药鹿茸提供一种科学、准确、可靠的鉴定方法。同时也表明市售鹿茸样品质量良莠不齐,混伪品大量充斥。

摘要：目的 通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)与核酸试纸条相结合的方法,实现鹿茸真伪的可视化检测。方法 采用十二烷基硫酸钠(sodium dodecylsulfate, SDS)碱变性法提取正品及伪品鹿茸样品基因组DNA,通过查找细胞色素C氧化酶亚基I(COI)特异性位点,应用Primer 3.0软件设计鹿茸特异引物,摸索PCR最佳反应体系及条件,建立PCR-核酸试纸条及琼脂糖凝胶电泳鉴定鹿茸真伪的最优条件。同时,通过克隆测序,验证鹿茸真伪鉴定的准确性。结果 本实验中正品鹿茸在PCR-核酸试纸条上均出现两条带,阴性对照及伪品出现一条带,与琼脂糖凝胶电泳结果吻合,且试纸条检测的灵敏度可达1 ng·μL^(-1)。对9个市售鹿茸样品检测,正品鹿茸5个,合格率为45%。结论 自主构建的PCR-核酸试纸条检测方法简单、快速、特异性较好,可在较短时间内实现鹿茸真伪的可视化检测,检测结果稳定,为中药材鉴定提供又一新的方法。

摘要：【目的】对鹿茸胶原多肽进行复合酶水解,优化水解工艺,并测定水解液分子量分布。【方法】以碱性蛋白酶和胰蛋白酶为供试酶类,选用酶解时间、pH值、酶解温度、加酶量为影响因素,采用响应面试验设计优化单酶水解条件,根据响应面试验所得到的单酶水解的最适条件,确定双酶复合水解方案。通过Sephadex G25测定鹿茸胶原多肽的分子量分布。【结果】碱性蛋白酶最优水解条件为：酶解时间3.6h,pH值10.50,酶解温度55℃,加酶量4%,水解液的水解度为22.03%;胰蛋白酶最优水解条件为：酶解时间3.2h,pH值8.00,酶解温度50℃,加酶量4.4%,水解液的水解度为15.81%。复合酶水解条件：酶解温度为52.5℃,调节pH值为10.50,加入4%的碱性蛋白酶酶解3.6h;调节pH值至8.00,加入4.4%的胰蛋白酶酶解3.2h,所得水解液的水解度可达33.42%。复合酶水解胶原多肽的分子量分布在400~1 400u。【结论】确定了鹿茸胶原多肽碱性蛋白酶和胰蛋白酶复合水解的工艺条件。

摘要：为了进一步开发利用鹿茸资源,在单因素试验基础上,选取提取温度、提取时间、酶用量为自变量,糖胺聚糖得率为响应值,应用Box-Behnken试验设计对鹿茸糖胺聚糖提取工艺进行了优化,模拟得出了二次多项式的回归方程,并使用SAS9.0软件对试验数据进行了分析。分析结果表明,鹿茸糖胺聚糖的最优提取条件为:酶用量为5.72%,提取温度为51.82℃,pH值为8.63,糖胺聚糖得率为2.89%。

摘要：【目的】检测鹿茸顶端组织GHR基因的表达，为鹿茸再生的分子机理研究提供理论依据。【方法】根据GenBank已发表的牛、山羊和绵羊生长激素受体（GHR）基因序列，用CLUSTAL W软件进行同源性分析，在保守序列设计克隆鹿GHR基因编码序列的引物。以3～4岁健康鹿生长30d的鹿茸顶端组织提取的总RNA为模板，利用RT-PCR技术克隆GHR基因的cDNA序列；并用原位杂交技术对GHR基因在鹿茸顶端进行组织定位。【结果】成功克隆到了1967bp的序列（GenBank登陆号为EU38．1142），该序列包含GHR基因的全部编码序列。鹿GHR基因与牛、羊、人GHR核苷酸同源性分别为97％，97％和80％，GHR蛋白氨基酸序列同源性分别为97．9％，97．6％和77．3％。杂交结果显示，在皮肤层、间叶细胞层、软骨膜层和软骨层的阳性组均有蓝色杂交信号。【结论】利用RT-PCR技术和原位杂交技术在鹿茸顶端皮肤层、间叶细胞层、软骨膜层和软骨层均检测到GHR的表达。

摘要：目的:优选鹿茸乙醇提取的最佳工艺。方法:方法:采用正交试验法,以游离总氨基酸的含量、浸膏率为指标,考察影响提取工艺的因素。结果:最佳工艺为A_2B_3C_1D_2,10倍量60%乙醇提取,提取4次,每次2 h。结论:提取工艺合理、可靠。

摘要：为了检测梅花鹿鹿茸顶端组织不同部位的端粒酶活性及端粒酶逆转录酶(TERT)基因的mRNA表达水平,分离鹿茸顶端组织的茸皮层、间充质层及软骨层,并进行细胞培养,利用TRAP银染法测定不同部位的端粒酶活性。再利用TRIzol试剂法分别提取茸皮层、间充质和软骨细胞的总RNA,逆转录合成cDNA。根据GenBank已发表的相关序列设计梅花鹿TERT基因部分序列特异引物并克隆TERT基因,采用相对荧光定量Real-time PCR法检测TERT在鹿茸顶端不同部位细胞的表达丰度。结果表明:在鹿茸顶端组织茸皮层、间充质层和软骨层均检测到了端粒酶活性,其中间充质层的端粒酶活性最高,软骨层次之,茸皮层端粒酶活性最低;而体外培养的不同代数间充质细胞的端粒酶活性无明显差异。成功获得了鹿茸组织TERT基因部分编码区cDNA序列,该基因长915 bp,编码305个AA;与牛、羊TERT基因进行同源性分析显示,核苷酸序列分别为94.89%和94.31%;氨基酸序列分别为92.16%和92.11%。相对荧光定量PCR差异分析发现,TERT基因在鹿茸顶端不同部位组织均有表达。其中,在间充质组织的表达水平高于软骨和茸皮层组织。

摘要：[目的]优化鹿茸中3种生物碱基的提取工艺。[方法]利用乙醇作为生物碱基的提取溶剂,为了确定鹿茸中这一组有效成分的准确含量,首先选择适宜的提取方法,并采用正交设计,对影响尿嘧啶、次黄嘌呤和尿苷3种生物碱基提取率的因素,如乙醇溶液浓度、溶剂用量、温度和时间等进行考察,并进行必要的单因素延伸实验,从而得到优化的提取鹿茸中3种生物碱基的工艺条件。[结果]确定了鹿茸中尿嘧啶、次黄嘌呤和尿苷3种生物碱基成分的含量,即在50%乙醇浓度∶物料=10∶1,60℃,45 min,4次提取的优化条件下,鹿茸中尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷的提取率分别为0.405 5 mg/g,0.504 9 mg/g0,.481 8 mg/g。[结论]研究结果可为鹿茸有效成分回收率的计算提供数据基础,为珍贵鹿茸资源的合理开发及利用提供科学依据。