摘要：黏着斑激酶（FAK）是一种相对分子质量为125 000的非受体型蛋白酷氨酸激酶，具有独特的结构功能特征，在细胞内信号转导中起关键性的作用，有胞内第一信号之称。我们以FAK基因为靶点，设计其两条反义寡脱氧核苷酸，通过直接注射瘤体的方法，观察其在动物实验中的抑瘤效果。

摘要：目的:构建靶向黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)基因的小干涉RNA(small interfering RNA,siRNA)质粒表达载体,转染人舌癌细胞Tca8113后观察其对FAK表达的抑制作用。方法:根据siRNA的设计原则,在人FAK mRNA序列中,设计并合成2条特异性靶序列寡核苷酸及2条无关对照序列,经退火成互补双链,再克隆到pGC-SilencerTM-U6/Neo真核表达载体中,构建重组体pSilencer-FAK并进行酶切鉴定;转染重组质粒至Tca8113细胞中,经G418抗性筛选,获得稳定转染细胞系;运用免疫细胞化学和Western-blot鉴定FAK的沉默效应。结果:质粒酶切证实目的寡核苷酸片段已被克隆到pGC-SilencerTM-U6/Neo载体中;pSi-lencer-FAK转染细胞后,FAK基因的表达受到明显抑制。结论:成功构建了针对人FAK的siRNA表达载体,通过转染Tca8113细胞可有效地抑制细胞中FAK的表达。

摘要：目的制备针对黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)的siRNA慢病毒载体,转染入原代培养的大鼠海马神经元细胞,筛选最佳的感染条件和沉默靶点序列。方法根据siRNA原理设计、构建、酶切、转化、PCR鉴定、阳性克隆测序并病毒包装3种靶向大鼠FAK的siRNA(T1,T2,T3),并转染至原代培养的大鼠海马神经元细胞,荧光显微镜观察转染效率,实时荧光定量PCR检测神经元细胞FAK基因表达,Western blot检测FAK蛋白表达。结果成功制备3种FAK siRNA慢病毒载体,并成功转染到神经元细胞中,在感染复数(MOI)为10并加入5μg/mL polybrene条件下转染率达到90%以上。T1、T2、T3均可抑制FAK基因及蛋白的表达,但T1沉默效果最好,敲除效率达到65%,与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论筛选出最佳的转染条件及最佳沉默靶向性序列T1,为后续研究整合素在阿尔茨海默病发病中的机制奠定了实验基础。

摘要：目的检测结肠癌细胞株中FAK的蛋白表达水平,并构建FAK靶向RNA干扰重组体。方法通过免疫细胞化学SP法和Western Blotting技术检测结肠癌细胞株SW480、HCT116、HT29、LOVO中FAK的表达水平;针对FAK序列设计并合成具有小发夹结构的两条DNA序列,经退火后再重组入pGenesil-1载体,并转化大肠杆菌DH5α,经酶切及测序鉴定后转染结肠癌HT29细胞株。结果FAK在SW480、HCT116、HT29、LOVO等细胞株中均有较高表达,其中HT29为最高。重组体经鉴定与设计序列一致,并稳定转染HT29细胞。结论FAK在4个细胞株中高表达可能对结肠癌及其进展有重要作用;FAK靶向RNA干扰重组体的成功构建和转染,为结直肠癌新的基因治疗方法提供可能的思路。

摘要：目的设计合成以PF-562271类似物为黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)的配体,来那度胺或泊马度胺类似物为E3连接酶配体的PROTAC(proteolytic targeting chimera),并对其降解FAK蛋白的活性进行评价。方法以对氟硝基苯为起始原料,经取代、还原、脱除保护基、环合、还原、酰化等反应得到目标化合物。采用Western blot技术测试PROTAC分子对A549细胞中FAK蛋白的降解活性。结果与结论合成了6个PROTAC分子,目标化合物结构经1H-NMR和HR-MS确证。Western blot测试表明6个目标化合物对A549细胞中的FAK蛋白均具有降解活性,其中化合物Ⅱa的蛋白降解活性较强,在10 nmol·L^(-1)浓度下FAK蛋白降解率为52%,具有进一步研究价值,该研究为后续开展以FAK为靶点的PROATC分子的研究奠定了基础。

摘要：目的探讨靶向黏着斑激酶(FAK)基因的短发卡状RNA(shRNA)对大鼠肝星状细胞系HSC-T6活化与增殖的影响。方法分别设计2对有小发卡结构的DNA序列及1对非特异对照序列,构建重组质粒载体,经阳离子聚合物介导转染HSC-T6细胞。通过real-timePCR与Western blot进行筛选鉴定,改良MTT法观察细胞增殖,Western blot检测HSC活化的标志物α-SMA的表达。结果shRNA1、shRNA2均能抑制FAKmRNA和蛋白表达(P<0.05),其中shRNA2对FAK基因抑制率达76.82%,且可明显抑制HSC-T6细胞α-SMA的表达及细胞增殖。结论靶向FAK基因的shRNA可以抑制HSC-T6细胞的活化与增殖。

摘要：目的研究纤维连接蛋白(fibronectin,FN)对人结肠癌细胞侵袭力的影响,并探讨其中的信号传导机制。方法以递增浓度的 FN 刺激结肠癌细胞株 Colo320,以免疫沉淀和蛋白质印迹法检测结肠癌细胞内黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)第397位酪氨酸(tyr-397)磷酸化的状况,以改良Boyden 小室法检测相应的细胞侵袭力变化。设计反义寡核苷酸阻断 FAK 蛋白质表达,再次观察接受FN 刺激后,结肠癌细胞内 FAK tyr-397磷酸化状况及细胞侵袭力的改变。结果 FN 能够促进 Colo320FAK tyr-397磷酸化,在一定范围内具有剂量依赖性。FN 浓度达10nmol/L 时,此作用最显著,继续增加 FN 浓度,FAK tyr-397磷酸化不再呈现继续增强趋势,当浓度达到100 nmol/L 时,磷酸化程度反而有所下降;FN 可以增强细胞侵袭力,同样在一定范围内具有剂量依赖性;反义寡核苷酸干预后,结肠癌细胞内 FAK tyr-397磷酸化及细胞侵袭力均有显著降低(P<0.01)。结论 FN 可以有效增强结肠癌细胞的侵袭力,其作用是通过 FN-FAK 信号通路实现的,FAK 的活性形式是其酪氨酸位点的磷酸化,阻断 FAK 的表达可以减弱 FN 促进细胞侵袭的作用。

摘要：目的构建RNA干扰(RNAi)重组体抑制黏着斑激酶(FAK)表达,并探讨其对结肠癌多细胞球体(MCSs)形成的影响。方法针对FAK cDNA序列设计并合成1对特异性的含有短发卡的寡核苷酸序列及其对照序列,经退火后插入pGenesil-1中构建重组体。经双酶切鉴定和DNA测序后,用脂质体2000将其转染结肠癌HT29细胞,并用G418稳定筛选,采用Real-time PCR和Western blot检测干扰前后FAK在HT29内的表达变化,并作细胞悬浮培养观测靶向干扰FAK对MCSs形成的影响。结果双酶切和测序鉴定证实插入序列完全正确;靶向干扰FAK后,其mRNA和蛋白表达分别显著下调(79.20±2.97)%和(78.47±4.39)%,且细胞不易聚集形成MCSs。结论成功构建FAK靶向RNAi重组载体,显著地抑制FAK表达,并能有效地抑制MCSs的形成。

摘要：目的设计合成2,4-二取代-5-(三氟甲基)吡啶类局部黏着斑激酶(FAK)抑制剂,并对其酶抑制活性进行评价。方法以3-氰基-2-氟吡啶为起始原料,经过取代、还原、环合、酯化和偶联反应得到目标化合物Z1~Z8。采用HTRF技术测试目标化合物对FAK的体外酶抑制活性,以MTT法检测细胞增殖抑制活性。结果与结论合成了8个2,4-二取代-5-(三氟甲基)吡啶类化合物,目标化合物的结构经^(1)H-NMR和MS谱确证;初步体外酶活性测试和MTT法检测细胞增殖抑制活性结果表明,8个化合物均有良好的酶抑制活性和细胞增殖抑制活性,其中化合物Z6的体外酶抑制活性和细胞增殖抑制活性较强[FAK:IC_(50)=6.6 nmol·L^(-1),U87-MG:IC_(50)=(6.66±0.19)μmol·L^(-1),A549:IC_(50)=(7.68±3.41)μmol·L^(-1)],具有进一步研究价值。

摘要：目的了解FAKSiRNA对于体外培养的增生性瘢痕成纤维细胞中与瘢痕增生相关因子整合素α1、TGF-βR、黏着斑激酶(Focal adhesive kinase,FAK)及α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)表达的影响,探索治疗增生性瘢痕的基因治疗方法。方法设计特异性探针合成FAKSiRNA片段,脂质体法转染体外培养的增生性瘢痕成纤维细胞,并用荧光定量PCR法(FQ-PCR)检测、比较转染前后成纤维细胞内以上各因子的mRNA表达量的变化。结果转染48h后,FAKmRNA、整合素α1mRNA、TGF-βRmRNA、α-SMAmRNA的表达明显下降(P<0.05)。结论FAKSiRNA可能通过抑制增生性瘢痕成纤维细胞中整合素α1、TGF-βR、FAK和α-SMA的表达,从而抑制瘢痕的增生与挛缩。