摘要：AIM:To design and validate broad-range 16s rRNA primers for use in high throughput sequencing to classify bacteria isolated from the human foregut ***:A foregut microbiome dataset was constructed using 16s rRNA gene sequences obtained from oral,esophageal,and gastric microbiomes produced by sanger sequencing in previous studies represented by 219 bacterial *** primers evaluated were from the European rRNA *** assess the effect of sequence length on accuracy of classification,16s rRNA genes of various lengths were created by trimming the full length *** spanning various hypervariable regions were selected to simulate the amplicons that would be obtained using possible primer *** sequences were compared with full length 16s rRNA genes for accuracy in taxonomic classification using online software at the Ribosomal Database Project (RDP).The universality of the primer set was evaluated using the RDP 16s rRNA database which is comprised of 433 306 16s rRNA genes,represented by 36 ***:Truncation to 100 nucleotides(nt)downstream from the position corresponding to base 28 in the Escherichia coli 16s rRNA gene caused misclassification of 87(39.7%)of the 219 sequences,compared with misclassification of only 29(13.2%)sequences with truncation to 350 *** 350-nt sequence reads within various regions of the 16s rRNA gene,the reverse read of an amplicon generated using the 343F/798R primers had the least(8.2%)effect on *** comparison,truncation to 900 nt mimicking single pass sanger reads misclassified 5.0%of the 219 *** 343F/798R amplicon accurately assigned 91.8%of the 219 sequences at the species *** by abundance of the species in the esophageal dataset,the 343F/798R amplicon yielded similar classification accuracy without a significant loss in species coverage(92%).Modification of the 343F/798R primers to 347F/803R increased their universality among foregut ***

摘要：采用分子动力学方法(Molecular dynamics,MD)对托普霉素(Tobramycin)与16s rRNA的A位点复合物的特异性识别机制进行了理论模拟研究,模拟时间为3.6ns.结果表明,A位点中波动最大的部位是两个环外碱基A1492和A1493;tobramycin的环Ⅰ和环Ⅱ是其最保守的结构单元,可能参与了Tobramycin与16s rRNA的A位点之间的特异性识别.另外,发现一个残存时间为3.6ns的'结构化'水分子,它桥接了Tobra-mycin环Ⅱ的N3与环Ⅰ的N6′之间的氢键,稳定了Tobramycin的结构;Tobramycin周围水合密度较高的位点出现在环Ⅰ和环Ⅱ附近,这也正是晶体结构中形成较多水媒介氢键及动力学模拟中结构化水分子出现的位置.动力学模拟证实Tobramycin与16s rRNA间的结合是大量氢键及水分子相互作用的结果,这有助于设计和开发以Tobramycin为基础,具有高亲和力及特异性的16s rRNA抑制剂.

摘要：对20余种细菌16srDNAs进行多序列比对与进化树分析,设计铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa,PA)荧光定量PCR(fluorescencequantitativePCR,FQ-PCR)特异性引物。提取PA基因组DNA,以特异性引物扩增16srDNA靶片段,并构建重组质粒pMDT-Pfr。将梯度稀释的pMDT-Pfr质粒作为模板,用于建立定量标准曲线。以sYBRGreenI荧光染料建立20μL反应体系,对不同浓度的PADNA样品进行FQ-PCR检测。同时,以金黄色葡萄球菌、伤寒杆菌、福氏志贺菌、变形杆菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌和结核杆菌的基因组DNA作阴性对照,验证FQ-PCR方法检测PA的特异性。结果显示,设计的FQ-PCR引物的靶向序列,仅对PA16srDNA有高度同源性;FQ-PCR方法检测PA,其灵敏度达3.6pg/μL的基因组DNA或(2.1×103±3.1×102)拷贝/μL的16srDNA基因,并且具有很强的特异性;从细菌DNA提取到FQ-PCR检测,可在2h左右完成PA鉴定。较传统的培养鉴定法而言,以16srDNA作为FQ-PCR靶基因快速检测PA,具有很好的研究价值与应用前景。

摘要：玉米细菌性枯萎病是玉米上的重要种传病害,病原菌为Pantoea ***。本研究设计了16s通用引物,扩增该病菌及其近似种的16s rDNA,通过序列测定和分析,针对该病菌设计了特异性引物,采用nested-PCR技术,能够准确地区别该病菌及其近似种,检测的灵敏度在DNA水平上达到10-3pg级,检测活菌则达到2 cfu。检测人工污染的玉米种子时,不受种子提取液中其它物质的干扰,灵敏度依然达到2 cfu。

摘要：目的:探讨肝阳上亢型急性脑出血患者与健康人群的肠道菌群差异。方法:选取2018年于广州中医药大学第一附属医院颅脑科病房收治的9例肝阳上亢型急性脑出血患者的粪便样本为观察组,同时,选取体检的6例健康人粪便样本为对照组,提取两组样本中细菌总DNA,根据16s rRNA V4区设计引物进行扩增,通过Illumina Miseq平台进行双端测序(paired-end),通过生物信息分析软件对测序结果进行分析,比较两组样本菌群组成和结构。结果:操作分类单元(OTU)的韦恩图分析(Venn分析)显示观察组与对照组之间OTU数目存在明显差异。偏最小二乘法-判别分析(PLs-DA)显示肝阳上亢型急性脑出血患者与健康人在肠道菌群组成上具有明显差异。物种及其丰度分析上,门分类水平上观察组厚壁菌门与拟杆菌门的相对丰度比值(F/B)较正常组明显增加,其中疣微菌门的相对丰度明显低于对照组(P <0. 05)。属分类水平上,两组的普雷沃氏菌属、拟杆菌属、阿克曼氏菌属、布劳特氏菌属、氨基酸球菌属相对丰度差异有统计学意义(P <0. 05,P <0. 01),其中观察组拟杆菌属和普雷沃氏菌属的相对丰度比值(B/P)显著高于对照组。种分类水平上两组在普氏菌、阿克曼粘细菌、卵形拟杆菌、脆弱拟杆菌、伶俐瘤胃球菌上具有明显差异(P <0. 05,P <0. 01)。主坐标分析显示两组样本被显著分开,说明两组样本菌群结构存在显著差异。结论:肝阳上亢型急性脑出血与肠道菌群结构紊乱有关,其中普氏菌和阿克曼粘细菌的相对丰度下降是其发生的主要原因。

摘要：【目的】利用分子生物学方法对一株甲烷氧化菌Methylosinus trichosporium IMV3011中的16s rDNA和溶解性甲烷单加氧酶基因序列进行分析并探索其进化分类地位。【方法】利用基因数据库已有的基因序列信息,设计PCR扩增引物和基因测序引物,对溶解性甲烷单加氧酶基因和16s rDNA进行扩增和测序,并进行溶解性甲烷单加氧酶的6个基因和氨基酸序列与同类菌株的相应序列进行联配分析。【结果】获得了全长为5319bp甲烷单加氧酶基因序列和长度为1290bp的16s rDNA序列。该菌株与Methylosinus trichosporium OB3b中相对应基因的同一性是99.0%～82.7%,MMOX氨基酸序列的同一性为99.4%～81.8%,相似性为99.8%～89.2%。基于以上分析表明MMOX组分有很高的序列保守性,特别是在活性中心区域。【结论】菌株IMV3011属于甲基弯菌属,最近似的菌株是Methylosinus trichosporium OB3b。

摘要：Revealing biodiversity in microbial communities is essential in metagenomics researches. With thousands of sequenced 16s rRNA gene available, and advancements in oligonucleotide microarray technology, the detection of microor-ganisms in microbial communities consisting of hundreds of species may be possible. Many of the existing strategies developed for oligonucleotide probe design are dependent on the result of global multiple sequences alignment, which is a time-consuming task. We present a novel program named Oligosampling that uses MCMC method to design group-specific oli-gonucleotide probes. The probes generated by Oligosampling are group specific with weak crosshybridization potentials. Furthermore a high coverage of target sequences can be obtained. Our method does not need to globally align target sequences. Locally aligning target sequences iteratively based on a Gibbs sampling strategy has the same effect as globally aligning sequences in the process of seeking group-specific probes. Oligosampling provides more flexibility and speed than other software programs based on global multiple sequences alignment.

摘要：利用细菌16s rDNA基因的通用引物对16个供试菌株进行PCR扩增,把扩增产物进行核苷酸序列测定。将获得的序列与GenBank中相关菌株的16s rDNA序列进行同源性分析。以此设计出检测A.a.c的特异性引物,并利用最大简约法构建了16s rDNA系统演化树。系统演化关系分析表明,6～9号供试菌株的16s rDNA序列与A.a.c标准菌株仅有3个位点的差异,其同源性均在99.8%以上,在构建的系统演化树上,它们聚为同一个族群。利用设计的一对特异性引物(BFB64/65),对各供试菌株进行PCR检测,结果只有A.a.c相关菌株产生扩增条带,产物大小与预期一致。

摘要：目的:应用细菌的16s rRNA/rDNA序列设计引物,PCR检测经益生菌治疗后肠道菌群的相对变化,观察益生菌VsL#3对大鼠实验性结肠炎的保护作用。方法:将24只sD大鼠以三硝基苯磺酸(TNBs)乙醇溶液一次性灌肠造成急性实验性结肠炎模型,并随机分成3组,即模型组、VsL#3组和5-氨基水杨酸(5-AsA)组,分别给予生理盐水、益生菌VsL#3、5-AsA灌胃。观察各组大鼠一般情况、体重、大便的改变。1周后处死大鼠,观察结肠病理变化,比较每组炎症积分。留取大便样本,分别进行双歧杆菌、大肠杆菌、乳酸杆菌的培养、计数。应用细菌的16s rRNA/rDNA序列设计引物,对大鼠肠道双歧杆菌、大肠杆菌、乳酸杆菌和通用细菌的16s rDNA基因进行PCR检测,并计算前3种细菌16s rDNA基因的相对扩增产物以观察肠道菌群的变化。结果:TNBs造模1周内各组大鼠均出现懒动、食量下降、腹部膨胀、毛色无光泽、体重下降、腹泻、便血的表现。处死后发现每组均有不同程度的结肠、回盲部扩张,局部结肠淤血、与周围组织黏连,肠黏膜有出血点、溃疡甚至糜烂或肠黏膜脱落,以模型组最明显。VsL#3组和5-AsA组的炎症评分显著低于模型组(P<0.05)。经PCR及细菌培养的方法均显示VsL#3组肠道大肠杆菌含量低于另两组(均为P<0.01),而双歧杆菌和乳酸杆菌含量显著高于另两组(P<0.01或P<0.05)。结论:利用细菌16s rRNA/rDNA设计引物,对多种肠道细菌相对含量进行PCR检测,发现益生菌VsL#3可通过调节肠道菌群,达到对大鼠实验性结肠炎的治疗效果。

摘要：弧菌是海水中最常见的细菌类群之一。弧菌属的一些种是致病菌,能引起海洋生物弧菌病,给养殖业造成损失。根据已有弧菌16s核糖体RNA基因(16s rDNA)序列,设计了3条弧菌属特异引物VF169、VR744和VR1150,与细菌16s rDNA通用引物VF27一起,组成VF169/VR744、VF169/VR1150和VF27/VR744 3引物对。从海水中直接提取浮游生物总DNA,用VF169/VR744,VF169/VR1150和VF169/VR744(巢式)以及VF27/VR744引物分别扩增弧菌16srDNA片段并克隆,分别构建了弧菌16s rDNA片段变异类型文库。从各文库中分别随机选取一定数量的克隆测序,共获得72条序列。系统学分析表明所有72个序列都与已知的弧菌属细菌的序列聚类,具有很高的相似性,证明所设计的引物能用于海水样品弧菌菌群分析。另外,VF27/VR744既具有对海洋弧菌的高度特异性,也具有恰当的海洋弧菌覆盖面,是1对选择扩增海水中弧菌16s rDNA的较理想引物。从获得序列的分布情况看,胶州湾存在较高的弧菌多样性,其中,类灿烂弧菌菌群(Vibrio splendidus-related group)是优势类群。