摘要：为了解猪嵴病毒(PKV)的流行及变异情况,本研究根据PKV的3d基因保守区域核苷酸序列设计一对特异性引物,并利用RT-PCR方法对2012年来自24个省市84个猪场的病料样品共计236份进行3d基因的检测。结果显示:在236份病料中,共有63份为PKV阳性,阳性率为36.69%;而在检测的84个猪场中,共有36个猪场显示PKV阳性,猪场阳性率为42.85%。此外,对2012年分离的9个PKV部分3d基因进行测序分析,并与GenBank中登录的人、牛、猪以及鼠等嵴病毒株相关序列进行遗传变异分析。结果表明9个PKV 3d基因与国内外其他PKV株无论是在核苷酸水平上还是在氨基端水平上均具有较高的同源性,表明PKV的3d基因具有较高的保守性,可以作为病原检测的靶基因。

摘要：根据GenBank中的I型鸭肝炎病毒全基因序列设计了扩增I型鸭肝炎病毒VP1、3d基因的引物,用该特异性表达引物从I型鸭肝炎病毒cdNA模板中扩增得到目的基因VP1、3d,用相同的限制性内切酶酶切目的基因和表达载体pET32a后构建重组表达载体,转化宿主BL21(dE3),用不同浓度的IPTG诱导VP1、3d基因的表达,收集菌液进行SdS-PAGE电泳,Western-blotting分析蛋白免疫原性。结果表明,VP1、3d在大肠杆菌中表达量较高,表达产物的分子量约为48kd、68kd,并能被兔抗dHV-1血清所识别。I型鸭肝炎病毒VP1、3d蛋白在大肠杆菌中表达产物具有免疫原性。

摘要：根据血清1型鸭甲型肝炎病毒(dHAV-1)SH株3d基因序列设计并合成1对特异性引物,通过RT-PCR方法扩增3d基因,将其克隆入原核表达载体p ET-32a,转化大肠杆菌BL21(dE3),在IPTG的诱导培养下重组蛋白获得了成功表达。SdS-PAGE显示重组蛋白的分子量约为68 k d,Western blot分析显示该重组蛋白能与多聚组氨酸标签单抗发生特异性反应。将切胶后纯化的目的蛋白免疫ICR小鼠,制备针对重组蛋白的多抗血清,Western blot结果显示制备的抗血清能够与dHAV-1感染的SPF鸡胚尿囊液总蛋白发生特异反应。以上结果表明,3d基因在大肠杆菌中获得了成功表达,且制备的多抗血清可以用于3d蛋白的检测,为3d蛋白的功能研究奠定了基础。

摘要：根据Genbank中的Ⅰ型鸭肝炎病毒全基因序列,应用Primer 5.0分析软件设计合成了扩增I型鸭肝炎病毒3d基因的一对引物,用该特异性表达引物体外克隆Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒3d基因,构建重组表达质粒pET32a-3d,将此重组质粒转化到受体菌RossetaⅡ(dE3)中进行诱导表达。SdS-PAGE和蛋白质印迹分析表明,诱导4 h后表达量达到最高,表达产物大小约为70 Ku,表达蛋白能与I型鸭病毒性肝炎阳性血清产生特异性免疫反应。

摘要：根据GenBank中登录的猪嵴病毒(porcine kobuvirus,PKV)3d基因序列特征设计特异性引物,采用RT-PCR方法从福建省某猪场采集腹泻粪便样品和小肠组织混合物中扩增猪嵴病毒3d基因,将扩增后的目的片段克隆后进行序列测定。结果表明,所扩增的目的片段编码有完整的3d开放阅读框,全长为1 407bp,编码有468个氨基酸。运用生物信息学软件,将获得3d基因序列和GenBank的猪嵴病毒株3d基因序列进行分析比较,该毒株的3d基因序列和SH-W-CHN/2010/China毒株的核苷酸同源性最高,为93.6%,与WH1株核苷酸同源性最低,为92%。从遗传进化上看,猪嵴病毒和其他中国株在遗传进化上处在一个同一分支,匈牙利分离株处在另一分支,表明猪嵴病毒可能在欧亚大陆上各自独立进化。

摘要：牛肠道病毒（Bovine enterovirus,BEV）是2011年在我国部分牛场新发现的一种消化道病毒病病原,因此亟需建立针对BEV快速、有效的检测方法。本研究根据BEV 3d基因保守序列,设计并合成一对特异性引物,建立了检测BEV的SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR方法。该方法与引起牛的病毒性腹泻的其它几种牛的病毒均无交叉反应,检出敏感度达7.13×10^1拷贝/μL,比常规RT-PCR检测方法高10倍。应用该方法检测了3个规模化奶牛场送检的41份奶牛腹泻样本和3份气溶胶样本,腹泻样品阳性检出率为39.02%（16/41）;3份气溶胶样本均为阳性,表明该方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可同时检测大量临床样本,本方法为BEV的早期快速诊断和定量分析提供了技术支撑。

摘要：针对猪脑心炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)3d基因保守序列的6个特异性部位设计了2对引物,利用Bst dNA聚合酶,63℃恒温保持50min即可完成反转录与扩增反应,产物中加入SYBR GreenⅠ染料,在紫外光下可直接观察判定扩增结果,试验成功建立了猪EMCV的RT-LAMP检测方法。结果表明:该方法灵敏度比RT-PCR高100倍,具有良好的重复性和稳定性,而且对其他病毒均无扩增结果,可作为猪EMCV的快速诊断方法。

摘要：根据猪捷申病毒(PTV)Swine/CH/IMH/03株核苷酸序列,设计了1对特异性引物,以全长基因组重组质粒pSK-PTVFL为模板扩增了3d基因,并将扩增产物定向克隆到原核表达载体pET30a(+)中,阳性质粒转化BL21(dE3),阳性菌经0.3 mmol/L IPTG诱导后,进行Western-blotting检测。结果显示,3d蛋白获得了高效表达,表达量占菌体总蛋白的66.1%,且重组蛋白能与PTV Swine/CH/IMH/03株阳性血清发生特异性反应。表明,3d蛋白能在大肠杆菌中高效表达,并具有良好的免疫原性,这为开发相应的鉴别诊断技术奠定了基础。

摘要：为了解猪嵴病毒(PKV)在山东省内的流行情况,本研究根据PKV的3d基因保守区域设计一对引物,对2014年冬~2016年冬来自山东省350份病料样品进行RT-PCR检测和统计分析。结果显示:在350份病料样品中,PKV阳性率为56%(196/350),阳性猪场占80%(24/30);非腹泻猪个体阳性率(65.38%,153/234)明显高于腹泻猪个体阳性率(37.07%,43/116);育肥猪的PKV阳性率(97.50%)远高于哺乳期仔猪(45.40%)、断奶期仔猪(52.75%)以及成年猪(66.67%);夏秋季节采集的样品PKV检出率(71.94%)明显高于冬春季节(45.50%)。统计PKV与PEdV、TGEV混合感染结果显示,虽然PKV在非腹泻猪群中单独感染率(61.11%,143/234)远高于腹泻猪群(18.97%,22/116),但非腹泻猪群PKV与PEdV和TGEV的混合感染率却明显低于腹泻猪群。对5份PKV阳性样品的3d基因测序分析显示,5份阳性样品该基因核苷酸同源性为90.8%~99.7%,与GenBank中的参考株之间的核苷酸同源性为88.8%~94.1%。上述研究结果表明在山东省范围内PKV感染与猪腹泻之间无必然关系,PKV的3d基因进化与病毒株的分离年代和地域无明显相关性。

摘要：本研究通过核酸探针与免疫层析相结合的方法,建立了一种简单、敏感、特异的检测口蹄疫病毒的方法。试验利用RT-PCR方法获得口蹄疫病毒3d核苷酸片段,在引物中设计了灵敏度高、特异性好的核酸探针——生物素和地高辛,使扩增产物结合探针。利用胶体金的放大原理将链霉亲和素与金颗粒形成胶体金混合物,从而与RT-PCR产物中的生物素探针结合。硝酸纤维素膜上端标记生物素化山羊抗兔IgG作为指控条带,下端标记抗地高辛抗体以捕获RT-PCR产物中的地高辛探针。组装金标试纸条,检测RT-PCR产物,结果表明该核酸试纸条可以检测到0.3×10^-3-3×10^-3μg/μL,敏感性高于琼脂糖凝胶电泳,两种方法的符合率高,核酸试纸条检测方法是一种敏感性高、成本低且费时短的新型检测方法。该方法为口蹄疫病毒检测提供了一种新的思路。