摘要：目的:克隆幽门螺杆菌(Helicobacterprlori,Hpylori)前炎症外膜蛋白基因oipA,并对其进行生物信息学分析.方法:利用GenBank已公布序列设计引物,用PCK进行扩增后,酶切,连入载体pGEX-5X-1,并进行序列测定.用数据库Blast,NCBICDD,Swiss—model,Propred以及生物学软件Omigav2.0和Antheprotv5.0分析其生物学特性.结果:克隆片段与GenBank公布序列完全一致.经Blast比对未发现与oipA同源的其他种属基因,通过NCBICDD未找到已知保守区域和oipA编码氨基酸序列相关.应用Omigav2.0,Antheprotv5.0软件预测显示该蛋白具有良好的疏水性和抗原性,将该分析结果和Propred结果比对得到预测的抗原表位.结论:应用生物信息学技术,对幽门螺杆菌基因oipA进行分析,将为Hpylori与相关致病发生机制研究,Hpy-lori疫苗的开发等工作奠定一定基础.

摘要：大肠杆菌的tna a基因编码色氨酸酶,该基因的失活有利于大肠杆菌积累更多的L-色氨酸。利用CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑技术对大肠杆菌tna a基因进行敲除。首先针对tna a基因设计CRISPR/Cas9作用靶点,构建gRNA表达质粒;随后人工设计同源修复供体基因序列,构建成完整的CRISPR/Cas9基因敲除系统;将该系统应用到大肠杆菌w3110-Δ中,经PCR和测序鉴定,证实目的基因tna A敲除成功,敲除效率75%。成功构建了大肠杆菌tna a基因敲除菌,为大肠杆菌L-色氨酸高产菌株的构建奠定了基础。

摘要：目的克隆肺炎链球菌自溶酶(LytA)的基因序列,并进行重组表达。方法分别提取不同临床分离株的基因组DNA,根据已知肺炎链球菌野生R6株Lyta基因序列设计引物,进行PCR扩增,将获得的目的基因片段克隆入原核表达质粒,然后测序;利用生物信息学方法,对不同临床分离株Lyta基因序列进行比较分析,同时进行Lyta基因的重组表达。结果从不同临床分离株的基因组中均扩增出完整的Lyta基因片段,成功构建了重组质粒pGEX-4T-1-L-ytA。比较不同临床分离株Lyta基因的DNA序列及推测的氨基酸序列,发现各株Lyta基因序列及氨基酸序列间存在差异。通过异丙基巯基半乳糖(IPTG)诱导,Lyta基因在大肠埃希菌JM109中得到高效表达,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)结果显示pGEX-4T-1-L-ytA融合蛋白相对分子质量约62000,与理论预测一致。结论序列分析发现各分离株的Lyta基因序列及氨基酸序列间存在差异,但同源性极高,推测Lyta基因序列保守,可用于疫苗研发。

摘要：根据已经发表的副猪嗜血杆菌（HPS）sod a基因序列设计引物,对辽宁省HPS LN/111013株sod a基因进行特异性扩增、克隆及测序,获得长度为621bp的sod a基因完整序列。通过与已知代表毒株的sod a基因核苷酸及其编码的氨基酸进行同源性比对和系统进化树分析,结果显示核苷酸的同源性为97.3%～100.0%,氨基酸的同源性为95.2%～100.0%,表明该毒株与近年来国内外流行毒株的亲缘关系较近。通过与国内标准HPS强毒株（SH0165）sod a基因序列进行比对,发现该辽宁株核苷酸7个主要位点中在206,516,556处一致,而在48,147,450,597这4个位点不一致;氨基酸4个关键位点中16,49位点符合低致病力毒株特点,69,186位点符合高致病力毒株特点。而该毒株的临床发病情况和致病性试验表明其毒力较强,说明仅凭一个sod A毒力基因来判断该菌株的致病性还不够全面,或该辽宁株可能来源于高低菌株的变异或重组。

摘要：目的:构建小鼠Rel a基因的RNA干扰慢病毒载体,转染小鼠成骨样细胞并鉴定。方法:针对小鼠Rel a基因序列,设计特异性的sh RNA序列,应用基因重组技术插入慢病毒载体GV-248。得到的重组质粒转化感受态大肠杆菌DH5α,筛选得到阳性克隆并扩大培养。所得质粒进行测序分析确定载体构建成功。重组质粒载体及包装辅助质粒转染293T细胞,得到目的病毒并测定相应病毒滴度。慢病毒转染MC3T3-E1细胞后,Real-time PCR及Western blot检测MC3T3-E1细胞Rel a基因及成骨相关基因ALP、OCN、RANKL的表达。结果:成功构建小鼠Rel a基因的RNA干扰慢病毒载体,感染MC3T3-E1细胞后,Rel a基因的表达明显受到抑制,同时RANKL基因表达水平明显下降,ALP、OCN基因表达水平明显上升。结论:成功构建了小鼠Rel a基因的RNA干扰慢病毒载体。当小鼠成骨细胞Rel a基因表达被干扰,NF-κB通路被抑制后,小鼠成骨细胞成骨相关基因ALP、OCN的表达明显上升,成骨功能增强;同时RANKL的表达明显下降,其介导的破骨细胞骨吸收功能减弱。

摘要：首先提取采自甘肃玛曲的皮蝇一期幼虫的总RNA,合成cDNA,根据设计的特异引物,利用PCR技术扩增出Hypodermin A(HA)基因片段,将此片段与PGEM-T Easy载体连接,构建克隆载体PGEM-HA,转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆,进行测序与分析。结果表明,扩增的Ha基因长678bp,编码229氨基酸。克隆到的基因序列与NCBI GenBank上登陆的皮蝇Ha基因序列核甘酸同源性为96.6%,推导氨基酸同源性达97.8%。该基因的成功克隆为其进一步表达打下了坚实的基础。

摘要：目的运用实时荧光环介导等温扩增技术(LAMP)建立一种快速准确检测淋球菌的方法 ,以期用于淋病的早期临床诊断。方法以淋球菌por A为靶基因,设计保守性和特异性良好的引物,以淋球菌标准菌株基因组DNA为模板,进行LAMP扩增,用23种其他在生殖系统中存在的微生物验证其灵敏度和特异性。结果实时荧光LAMP法可检测到1 pg/μl(103 CFU/ml)淋球菌基因组DNA,稳定性良好,其针对23种其他在生殖系统中存在的微生物均不能扩增,por A引物对淋球菌高度特异,阳性结果 15 min可快速检出。结论成功建立了检测淋球菌por A的LAMP技术,为淋球菌的快速检测提供了新的手段,有望成为淋球菌常规检测的简便方法 。

摘要：采用自行设计的引物,应用PCR方法直接从广东分离株大肠埃希菌O157∶H7021210的染色体DNA中扩增出eaea基因的完整阅读框,得到了一条大小约为2 800 bp的基因片段。T-A克隆后将其亚克隆至原核表达载体pET-28a(+),经PCR鉴定、酶切鉴定及核苷酸序列测定,证实成功构建原核重组表达质粒pET-eaeA。大肠埃希菌O157∶H7 eaea基因的克隆及原核表达质粒的成功构建,为下一步进行诱导表达、活性鉴定及eaea基因表达蛋白诊断抗原的研制奠定了基础。

摘要：参照牛皮蝇HypoderminA(HA)基因的核苷酸序列,设计一对引物,以皮蝇总RNA为模板进行RT--PCR扩增牛皮蝇Ha基因,将扩增基因进行克隆测序。序列分析表明,所克隆获得的基因与GenBank中已经登录的核苷酸和氨基酸的同源性分别为97.2%和99.3%。同时,将该基因与表达载体PGEX-4T-1连接,构建并获得阳性重组表达载体。

摘要：嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是一种危害鳜鱼养殖生产的重要病原细菌,为进一步明确该病原菌的分子特征及建立快速检测技术,实验对引起翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)暴发性死亡的病原嗜水气单胞菌进行了致病性、菌株毒力特征研究,同时以嗜水气单胞菌气溶素基因aer A为分子靶标设计引物,利用环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)建立了病原嗜水气单胞菌的快速检测方法。结果表明,本次引起翘嘴鳜暴发性死亡的病原嗜水气单胞菌半致死浓度为1.6×10~6 CFU/m L,携带aer A等14种毒力基因,此14种毒力基因可用于其致病性分析及分子检测。以气溶素基因aer A设计引物进行的环介导恒温扩增,结果显示可扩增出阶梯状条带,加入SYBR Green I染色后呈现绿色的阳性反应,而对照组均未出现任何扩增条带且反应体系呈现橙色,表明LAMP检测方法对于嗜水气单胞菌检测具有很好的特异性;灵敏度检测的最低检测限为4.6×10~1 CFU/m L;10种经人工感染的淡水养殖鱼虾组织匀浆增菌液,提取DNA后进行LAMP方法检测,结果均可获得阳性扩增结果,而对照未染菌组呈阴性,表明该方法具有较好的应用性,可应用于嗜水气单胞菌引起的水生动物疾病的检测。