摘要：以单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,***)hly a基因为靶序列,设计5'端为RNA序列,3'端为DNA序列的嵌合引物和链终止Blocker序列,经过优化,建立实时荧光单引物等温扩增(Real-time fluorescence SPIA)方法,进行特异性、检出限实验,并对不同DNA提取方法进行比较。结果显示,确定荧光染料SPIA法的最佳反应温度为58℃,反应30 min,引物特异性良好,只有4株不同来源的*** DNA产生典型的S型荧光扩增曲线。对***纯培养DNA的检出限为3.6×10~1fg/μL,相应菌液浓度为1.2×10~1CFU/m L;Realtime fluorescence SPIA检测试剂盒法、水煮法、溶菌酶-蛋白酶K法、饱和酚提取法四种方法提取DNA,均产生典型的扩增曲线,Ct值没有明显差异。对人工添加猪肉火腿样品中的***,采用水煮法提取DNA的检出限为1.1×10~2CFU/g。结果表明,所建立的***的Real-time fluorescence SPIA新型等温扩增方法,特异性强、灵敏度高、不受DNA纯度的影响、快速、简便。

摘要：乳酸菌细菌素是一种广谱抑菌素,已成为天然食品防腐剂研究与开发的热点。文章进行了该类细菌素在大肠杆菌中的异源表达,并应用Western-blot鉴定。利用组氨酸标签纯化及Trx-Tag标签的切除,对重组蛋白的抑菌活性进行检测。根据GenBank数据库中公布的细菌素Avicin a基因设计引物,以本实验室分离自酸马乳中的乳酸菌XM-38株为模板,采用PCR方法扩增了细菌素Avicin A片段,利用原核表达载体pET-32a(+)构建重组质粒HIS-Trx-Avicin A,将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中表达,获得了可溶性表达的融合蛋白(HIS-Trx-Avicin A)。SDS-PAGE分析HISTrx-Avicin A蛋白大小约为42 ku,表达量约占菌体总蛋白的19%。经亲和柱层析纯化后,得到纯化的HIS-Trx-Avicin A蛋白,含量180μg/mL。用肠激酶对融合蛋白HIS-Trx-Avicin A进行解离,获得浓度为20μg/mL的目的蛋白Avicin A。对HIS-Trx-Avicin A进行Western-blot鉴定,表明该细菌素蛋白得到了重组表达,对多种菌的抑菌实验表明,该重组蛋白具有良好的抑菌活性,研究的Avicin A为食品添加防腐剂提供了一个切实可行的来源。

摘要：根据弧菌属细菌(Vibrio spp.)共有的rpo a基因序列,比对和设计了一对PCR引物,建立了能够快速而准确地检测弧菌属细菌的通用PCR检测方法,该方法对靶标DNA的检测灵敏度为58 fg/μL,对菌液的检测灵敏度为2.7×102cfu/m L,能够区分该属细菌与其它属的细菌,具有极高的特异性。使用建立的方法对分离自南美白对虾的病原菌进行了检验,并结合16S r DNA序列分析,结果显示待检测病原均为弧菌属的细菌,与测序结果一致,说明该检测方法可用于弧菌属细菌的检测和诊断。

摘要：为了明确青海省天峻地区青海血蜱传斑点热群立克次体带菌率及遗传进化特点,根据已发表的斑点热群立克次体外膜蛋白Ompa基因序列设计特异性引物,采用PCR方法对青海省天峻地区青海血蜱进行斑点热群立克次体检测,并对测定序列进行遗传进化分析。结果显示,在316个青海血蜱标本样品池中共检测到31个阳性样品,斑点热群立克次体(SFGR)带菌率为9.8%。遗传进化分析显示,TJ013与立克次体福建分离株FUJ98(AF169629)、黑龙江立克次体HL-93(AF179364)、HL-054(AF179362)及日本立克次体YM(U43795)处于同一分支;SFGR Omp a基因序列同源性分析结果显示,TJ013与立克次体福建分离株FUJ98(AF169629)同源性最高,为95.49%;与黑龙江立克次体绥芬分离株HLJ-054和虎林分离株HL-93的同源性均为91.44%;和日本立克次体YM同源性为90.24%。表明青海省天峻地区青海血蜱传斑点热群立克次体感染较为严重,应尽快制定防制措施,以免危及动物及人类健康。

摘要：研究建立一种实时荧光环介导等温扩增技术(Real-time?uorescence loop-mediated isothermal amplification,RF﹣LAMP)检测沙门氏菌的方法。利用inva基因设计引物,进行特异性验证,并对灵敏度和人工污染蛋糕的检出限进行测定。结果显示,沙门氏菌呈阳性结果,非沙门氏菌呈阴性结果,表明特异性良好。该方法检测纯培养物的灵敏度为6.3 cfu/mL,人工污染蛋糕样品的检出限为63 cfu/g。另外,利用该方法对65份糕点样品进行检测,并与GB 4789.4—2016方法进行比较,其敏感性、特异性和符合率分别为100%、98.44%和98.46%。该方法特异性好,灵敏度高,操作简单,可实时监测扩增反应,对沙门氏菌引起的食源性疾病的预防和控制具有重要意义。

摘要：建立单核细胞增生李斯特氏菌实时浊度LAMP检测方法。根据单核细胞增生李斯特氏菌hly a基因设计4条特异性引物,采用环介导等温扩增方法 (LAMP)建立单核细胞增生李斯特氏菌快速检测方法。建立的LAMP方法具有高度特异性,经对14株细菌进行扩增,单核细胞增生李斯特氏菌为LAMP阳性,其他菌株均为LAMP阴性。建立的LAMP方法对培养的单核细胞增生李斯特氏菌的检测下限为32 CFU/m L,可在60 min内完成扩增反应。用建立的LAMP方法对160份不同食品进行检测,共检出5份LAMP阳性样本,与传统培养方法结果一致。该方法与传统方法相比,可节省大量时间,且对试验仪器和操作人员的要求低,具有良好的实用性。

摘要：目的建立实时荧光单引物等温扩增(SPIA)检测阪崎克罗诺杆菌的方法。方法本文以阪崎克罗诺杆菌Omp a基因特异序列为靶序列,设计RNA-DNA组合引物和链终止序列,优化反应体系,对4株不同来源阪崎克罗诺杆菌和21株其他食源性致病菌进行实时荧光SPIA特异性分析,通过不同浓度梯度阪崎克罗诺杆菌菌悬液灵敏度的检测和添加有阪崎克罗诺杆菌的婴儿配方奶粉样品检出限的确定,评价方法的准确度。结果除4株阪崎克罗诺杆菌外,其他细菌均未出现特异性荧光扩增曲线,具有良好的特异性。在40 min内,实时荧光SPIA检测阪崎克罗诺杆菌纯培养基因拷贝灵敏度为每反应1 copies,相应活菌数为1.6×10-1cfu/ml;对婴儿配方奶粉模拟样品中阪崎克罗诺杆菌的检出限是1.5×100cfu/100 g。结论本研究建立的方法具有灵敏度高、特异性强、耗时短、操作简单等优点,适用于实验室快速检测阪崎克罗诺杆菌Omp a基因。

摘要：利用环介导等温扩增技术(LAMP)建立了一种对嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)进行快速检测的方法。基于嗜水气单胞菌tbp a基因,设计了一套引物,并优化了反应体系的温度、时间和Mg2+浓度,分析了该方法的特异性与灵敏度。结果表明,在59℃条件下,LAMP的最适扩增时间为40 min,能有效检测到1 pg/μL核酸浓度,且检测出嗜水气单胞菌为阳性,其他菌株为阴性,该方法耗时短,灵敏度高,特异性好,适合嗜水气单胞菌的快速检测。

摘要：为建立快速检测副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)毒力相关三聚自转运蛋白(Trimeric autotransporters,Vta A)的多重PCR方法,根据HPS Vta A Vta A1和Vta A3基因为模板,设计合成了2对特异性引物,进行多重PCR扩增及反应条件的优化,并对多重PCR扩增的敏感性和特异性进行了分析.结果表明:所建立的多重PCR检测方法对HPS Vta A1和Vta A3基因分别能扩增出406和291 bp的目的条带,最小检测限为3.4×107cfu/m L;此多重PCR方法只能检出HPS Vta A1和Vta A3基因400和300 bp大小的目的条带,而不能检出胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonella suipestifer)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、支气管败血波氏杆菌(Brodetella bronchiseptica)和猪链球菌(Streptococcus suis).由此证明,所建立的多重PCR方法操作简单、快速、特异性强和敏感性高,能够实现对HPS的快速诊断与检测.