摘要：目的:建立检测与鉴定布鲁氏菌a19疫苗株基因组DNA的巢式PCR方法。方法:通过全基因组序列比较,分析布鲁氏菌a19疫苗株与其他布鲁氏菌全基因组序列的差异位点,依据差异位点设计引物,建立检测与鉴定布鲁氏菌a19疫苗株基因组DNA的巢式PCR方法。提取布鲁氏菌a19疫苗株基因组DNA,倍比稀释后作为模板DNA,应用建立的巢式PCR方法进行灵敏性测试;同时,应用建立的巢式PCR方法检测除布鲁氏菌a19疫苗株之外的其他布鲁氏菌及非布鲁氏菌菌株基因组DNA,进行特异性测试。结果:建立的巢式PCR方法检测布鲁氏菌a19疫苗株基因组DNA最低检出限为3.43 fg,扩增结果显示,出现246 bp电泳条带,其他布鲁氏菌菌株出现314 bp电泳条带,而非布鲁氏菌菌株均未扩增出电泳条带。结论:建立的巢式PCR方法具有灵敏性高、特异性强的特点,反应体系中存在1个拷贝数的布鲁氏菌a19疫苗株基因组DNA,即可检测到,本方法适用于标本中布鲁氏菌a19疫苗株微量基因组DNA的检测与鉴定。

摘要：为建立一种可以鉴别布鲁菌a19疫苗株和其他布鲁菌的双重荧光定量PCR方法,分别设计特异性扩增布鲁菌BCSP31基因序列和a19疫苗株缺失序列的2套引物探针,对引物和探针浓度进行优化,并对其敏感性、特异性和重复性进行评价。结果表明,用该方法对2种阳性质粒标准品的最低检测限均为10拷贝/μL;该方法扩增a19疫苗株的核酸时只呈现出1条特异性的扩增曲线,扩增其他布鲁菌菌株(包括疫苗株与野毒株)的核酸时,会出现2条特异性的扩增曲线,而非布鲁菌的细菌核酸均未出现特异性的扩增曲线。该方法的批内和批间重复变异系数均小于3%,重复性良好。对122份临床样品的检测结果显示该方法的阳性样品检出率高于套式PCR检测方法和Bruce-Ladder PCR方法,并可对a19疫苗株的核酸进行鉴别。本研究建立的鉴别布鲁菌a19疫苗株的双重荧光定量PCR方法特异性好、灵敏度高、重复性好,可作为临床上进行a19疫苗株鉴别的一种检测方法。