摘要：背景与目的:研究表明,STAT3(signal transducer and activator of transcription 3)蛋白在多种肿瘤组织或细胞中高表达,STAT3蛋白可能参与了肿瘤的发生与发展。本研究拟设计筛选出针对STAT3的高效反义核酸,研究STAT3反义核酸对人肺腺癌细胞a549增殖及凋亡的影响。方法:用RNAStructure4.2软件和STAT3 mRNA全长序列设计出10组反义STAT3序列,并分别转染a549细胞;Cell Count Kit(CCK-8)检测细胞增殖变化,倒置相差显微镜观察细胞增殖和凋亡的变化;Hoechst33258染色观察细胞凋亡形态变化,AnnexinⅤ/PI复染检测细胞早期凋亡,Western blot检测STAT3蛋白表达和磷酸化,及其下游Bcl-xL蛋白表达的变化,用碘化丙啶(propidium iodide,PI)单染结合流式细胞仪检测细胞周期变化。结果:设计出的10条反义序列对a549细胞增殖有明显抑制作用,AS10对细胞的增殖抑制率达到75.46%;反义核酸浓度越高,对a549细胞的增殖抑制效应越强(P<0.01)。反义转染后,胞膜皱缩和核固缩形态的典型细胞凋亡明显增多,AnnexinV/PI双标流式细胞仪检测发现,反义转染后能够促进细胞的早期凋亡(P<0.01),早期凋亡率达11.51%;而正常对照组细胞的早期凋亡率为5.18%。STAT3蛋白及其下游Bcl-xL蛋白表达变化明显下降,STAT3蛋白磷酸化水平也降低。PI单染结合流式细胞仪检测发现,正常对照组的S期细胞为44.47%,G1期的细胞则为48.49%;反义转染后的S期细胞明显减少(23.70%),G1期细胞明显增多(63.96%)。结论:通过计算机辅助设计筛选得到的高效STAT3反义序列对a549细胞有强烈的增殖抑制作用,能有效促进a549细胞的凋亡,其机理与反义STAT3抑制STAT3蛋白表达、降低磷酸化水平、下调Bcl-xL基因以及使细胞发生G1期阻滞有关。

摘要：目的:研究CD44v3在透明质酸诱导a549细胞体外粘附和侵袭中的作用。方法:设计和构建能产生针对CD44v3的短发夹RNA(shorthairpinRNA,shRNA)的RNA干扰质粒,转染a549细胞,以RT-PCR和Westernblot检测a549细胞转染前后CD44v3表达,以平板粘附模型和波登氏小室模型检测a549细胞转染前后粘附和侵袭能力。结果:和转染前相比,转染了RNA干扰质粒的a549细胞CD44v3mRNA和蛋白表达以及受透明质酸诱导而粘附于平板和穿过波登氏小室隔膜的细胞数皆明显减少(P<0.01)。结论:CD44v3介导了透明质酸诱导人肺腺癌a549细胞体外粘附和侵袭行为。

摘要：目的探讨Napsin A基因转染至a549细胞对其上皮-间质转化(EMT)的作用和机制。方法采用慢病毒载体质粒PLJM1构建重组质粒PLJM1-Napsin A,将Napsin A基因转染至a549细胞染色体中并鉴定。用转化生长因子-β1(TGF-β1)刺激a549细胞构建体外EMT模型,倒置显微镜下动态观察细胞形态学的变化,观察Napsin A基因转染对a549细胞在体外EMT模型中细胞EMT和表达黏着斑激酶(FAK)的影响。结果重组质粒PLJM1-Napsin A测序结果与设计序列完全符合,转Napsin A基因a549细胞表达Napsin A蛋白显著高于非转基因细胞组(P<0.01)。细胞经TGF-β1刺激后形态上演变为间质细胞,E钙蛋白的mRNA和蛋白表达水平明显下调(P<0.01),相反Ⅰ型胶原则显著上调(P<0.01),提示体外构建EMT模型获得成功。转Napsin A基因a549细胞在TGF-β1干预后,其细胞形态间质改变、E钙蛋白和Ⅰ型胶原的表达量也发生相似变化趋势,但变化幅度显著变小(其中E钙蛋白:P<0.01,Ⅰ型胶原:P<0.05)。体外EMT模型中,细胞FAK蛋白表达量增多(P<0.01),但转基因细胞上调趋势明显小于未转基因细胞(P<0.01)。结论转染Napsin A基因至a549细胞可以部分阻滞细胞EMT进程,其作用机制可能与抑制整合素信号转导通路有关。

摘要：特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一种致病原因不明、进行性、慢性不可逆的间质性肺疾病。为探讨富含亮氨酸重复蛋白15(leucine-rich repeat-containing protein 15,LRRC15)在IPF的作用及调节机制,本研究构建了博来霉素(bleomycin,BLM)诱导的小鼠肺纤维化和a549细胞损伤模型,检测了LRRC15的表达变化。转染siLRRC15后分别采用MTT、GFP-RFP-LC3双荧光标记系统和免疫印迹等方法检测了细胞活性和自噬的变化。结果表明:BLM处理后,小鼠肺组织和a549细胞中LRRC15表达显著上调;将设计和合成的siLRRC15转入a549细胞,LRRC15的表达极显著降低,可以部分恢复BLM引起的细胞损伤;BLM处理a549细胞后,LC3-Ⅱ和P62蛋白呈现上升的趋势;GFP-RFP-LC3双荧光标记检测发现,BLM处理后自噬体数量明显增多;进一步用siLRRC15处理a549细胞后发现,自噬关键蛋白LC3-Ⅱ、ATG5、ATG7的表达增加,P62蛋白表达下调,自噬流的强度增加。以上研究结果说明LRRC15是IPF中上皮细胞损伤的指示剂,可能通过调节自噬参与纤维化过程中的调节,本研究为进一步阐明IPF的机制提供了必要的理论依据。

摘要：目的:探讨Hsa-mi R202(人微小非编码RNA-202)对肺癌a549细胞增殖的影响及分子机制。方法:将Hsa-mi R-202序列与pp G/mi R/e GFP/Blasitidin质粒定向连接,构建靶向Hsa-mi R-202基因的真核表达载体pmi R-202,运用脂质体将pmi R-202转染至a549细胞,WST-8法检测细胞增殖率,RT-PCR检测IL-10、mi R-202的相对表达水平,Western blot与ELISA检测IL-10蛋白的表达水平,构建荧光素酶报告基因载体验证mi R-202与IL-10的相互结合作用。结果:经DNA测序证实与设计完全一致,测序结果显示成功构建了mi R-202的真核表达载体(pmi R-202),pmi R-202对a549细胞的增殖抑制率(24、48、72 h)分别为12%、38%、52%,并具有时间效应关系,较空白对照组及阴性对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);RT-PCR结果显示,转染pmi R-202后,mi R-202的表达水平增加;过表达mi R-202能下调IL-10基因及蛋白的相对表达水平,其相对水平分别为25%、0.75,IL-10活性的相对表达量为3.26±0.43 pg/m L,较空白对照组及阴性对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05):荧光素酶活性结果显示,克隆IL-10-3'UTR的质粒与mi R-202 mimics共转染293T细胞,引起荧光素活性的减低。结论:pmi R-202有效抑制a549细胞的增殖,并具有时间-效应关系,其机制可能是mi R-202通过靶向结合IL-10的3'UTR从而下调其在a549细胞的表达有关。

摘要：目的:探讨成肾细胞瘤1-结合蛋白(Wilms'tumor 1-associating protein,WTAP)对人肺腺癌a549细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法:选用人肺腺癌a549细胞和HEK293T,设计两组shWTAP干扰序列,构建慢病毒载体质粒,在HEK293T细胞中包装慢病毒后感染人肺腺癌a549细胞,对照组感染277空载体质粒。用qPCR和WB实验检测a549细胞中WTAP mRNA和蛋白的表达水平,用BrdU实验、细胞划痕愈合实验、Transwell实验分别检测a549细胞的增殖、迁移和侵袭能力。结果:成功构建shWTAP-1和shWTAP-2两种慢病毒质粒,感染a549细胞后,与对照组比较,a549细胞中WTAP mRNA和蛋白表达水平显著下调(均P<0.05),细胞的增殖、迁移和侵袭能力显著降低(均P<0.05)。结论 :敲低WTAP基因的表达对人肺腺癌a549细胞的增殖、迁移和侵袭能力有显著抑制作用,WTAP基因的表达与肺腺癌的发生发展相关,WTAP可能是肺腺癌诊疗的一个潜在靶标。

摘要：目的：构建靶向K-ras的siRNA，研究K—rassiRNA对K-ras基因突变型肺癌细胞a549及K-ras野生型小细胞肺癌细胞NCI—H446生长和迁移的抑制作用。方法：设计并人工合成4条***（针对野生型K-ras基因的K—rassiRNA1-K—rassiRNA3；针对突变型K-ras基因的K—rassiRNA4），并分别转入a549和NCI—H446细胞。RT—PCR和Westernblotting检测不同K—rassiRNA对K—rasmRNA和蛋白表达的影响，MTr法检测不同K—rassiRNA对a549和NCI—H446细胞增殖的抑制作用。Transwell实验和Hoechst33258染色检测K—rassiRNA对细胞迁移和凋亡的影响。结果：靶向突变型K-ras的***—NA4能特异性抑制a549细胞中K-ras的表达，但对N-ras和H-ras的表达没有影响。K—rassiRNA4抑制a549细胞的增殖，但不影响含野生型K-ras基因的NCI—H446细胞的增殖。K—rassiRNA4还能诱导a549细胞凋亡、抑制a549细胞迁移。结论：针对突变型K-ras基因的siRNA可特异性抑制K-ras突变型肺癌细胞的增殖和迁移，并诱导该细胞凋亡，K—rassiRNA可望用于K-ras突变型肿瘤特别是肺癌的个体化治疗。

摘要：目的:本研究旨在应用RNA干扰技术,诱导转基因肺癌细胞HLCDG1基因沉默并观察其对肺癌细胞周期和增殖的影响。方法:构建HLCDG1基因短小干扰双链RNA表达载体,筛选HLCDG1基因表达沉默的肺癌细胞株并应用MTT和流式细胞仪分析这一肺癌细胞株增殖和细胞周期分布状况。结果:根据siRNA表达载体的设计原则,构建了能在哺乳动物细胞稳定表达的siRNA载体5个(4个位点匹配实验组和1个位点错配对照组),依次命名为pHL-si-1、pHL-si-2、pHL-si-3、pHL-si-4和pHL-si-c。上述载体分别与表达HLCDG1的重组体pcDNA3.1(+)/HLCDG1共转染a549细胞,筛选到一株共转染pHL-si-1载体和pcDNA3.1(+)/HLCDG1重组体的a549细胞,它几无HLCDG1基因表达,这株细胞暂命名为a549-HLCDG1-si-1。MTT和流式细胞仪分析表明,a549-HLCDG1-si-1细胞增殖能力明显提高,进入S期和G2+M期增多,滞留G1期减少。结论:采用RNAi技术特异阻断HLCDG1基因表达,验证了HLCDG1基因对a549肺癌细胞有生长抑制作用。

摘要：目的:探讨成纤维细胞生长因子13(fibroblast growth factor 13,FGF13)对非小细胞肺癌a549细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)的生成和凋亡的影响及其调控机制。方法:WB法检测FGF13在人正常肺上皮细胞BEAS-2B和肺癌a549、H460细胞中的本底表达量。采用FGF13过表达载体转染BEAS-2B和a549细胞;设计两组靶向FGF13的shRNA序列,构建慢病毒干扰载体,包装病毒后侵染a549细胞,采用qPCR和WB法检测干扰效果,DCFH-DA探针结合荧光酶标仪分析敲减FGF13对a549细胞内ROS水平的影响,MitoSOX与WB法检测对线粒体ROS水平及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4,NOX4)蛋白表达量的影响,Annexin V-FITC-PI双染法检测对细胞凋亡和Caspase-3及Cleaved Caspase-3蛋白表达的影响。结果:与BEAS-2B细胞相比,FGF13蛋白在两种肺癌细胞中均高表达(均P<0.05)。成功构建FGF13过表达、低表达的a549细胞系。过表达FGF13后,BEAS-2B和a549细胞内ROS水平显著降低(P<0.05);敲减FGF13表达后,a549细胞内ROS水平显著升高(P<0.05);然而过表达及干扰FGF13对a549细胞内线粒体ROS水平无显著影响,但NOX4蛋白表达量显著下调(P<0.05)及显著上调(P<0.05)。FGF13干扰后a549细胞凋亡率显著升高(P<0.01),Caspase-3及Cleaved Caspase-3蛋白表达量显著上调(P<0.05)。结论:FGF13可能通过NOX家族途径调控ROS的生成,并通过ROS/Caspase-3通路调控a549细胞凋亡。

摘要：目的长片段双链COX-2RNA(dsRNAs)在体外经Dicer酶消化获得小RNA(D-siRNAs)抑制a549细胞COX-2的表达。方法(1)IL-1β5 g/L干预a549细胞,Western blot法观察其COX-2蛋白表达的时间依赖性。(2)Trizol法抽提a549细胞总RNA,RT-PCR扩增COX-2基因。(3)设计两端带T7 promoter,SP6 promoter的COX-2cDNA的PCR引物,通过PCR方法,获得两端带T7及SP6 promoter的COX-2DNA。(4)用RiboMAX Large Scale RNA Produc-tion Systems-SP6 and T7试剂盒体外将COX-2DNA转录为RNA。(5)长片段COX-2RNA经Dicer酶消化为小RNA(D-siRNAs)。(6)用TransMessenger Transfection Reagent将D-siRNAs转染a549细胞。(7)COX-2mRNA表达用RT-PCR检测,细胞培养上清液中PGE2含量用ELISA测定。结果(1)IL-1β干预a549细胞9 h后COX-2表达到高峰。(2)在体外,长片段COX-2dsRNAs经Dicer酶消化获得D-siRNAs。(3)D-siRNAs可有效抑制a549细胞COX-2的表达并降低PGE2的分泌。结论长片段双链COX-2RNA(dsRNAs)在体外经Dicer酶消化获得小RNA可有效抑制a549细胞COX-2的表达。