摘要：目的构建人葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78 k D,GRP78)shRNA真核表达质粒,并建立其稳定转染a549细胞系。方法根据Gen Bank中登录的人GRP78基因序列(3309)设计3对互补寡聚单链DNA干扰序列(GRP78-mi R-1、GRP78-mi R-2、GRP78-mi R-3)及1对阴性对照,分别插入至载体pc DNA6.2TM-GW/Em GFP,构建shRNA真核表达质粒。在Lipofectamine 3000介导下将各shRNA真核表达质粒分别转染a549细胞,并经Blasticidin S HCl加压筛选稳定的转染细胞系。实时荧光定量PCR和Western blot法检测a549细胞中GRP78基因m RNA转录和蛋白表达水平。结果各shRNA真核表达质粒经测序鉴定证明均构建正确。稳定转染shRNA真核表达质粒的a549细胞,在荧光显微镜下可见均一表达绿色荧光。与空白对照组比较,a549细胞中GRP78基因m RNA转录和蛋白表达水平明显降低(P0.05)。结论成功构建了人GRP78的shRNA真核表达质粒,并建立了其稳定转染的a549细胞模型,为进一步研究GRP78在肺癌细胞的侵袭和转移中的作用机制奠定了基础。

摘要：背景与目的透明质酸参与了多种肿瘤细胞黏附侵袭行为。layilin是一种新发现的与细胞骨架有密切联系的透明质酸受体。本研究的目的是观察针对layilin的短发夹RNA(shorthairpinRNA,shRNA)对体外培养的人肺腺癌a549细胞layilin表达及受透明质酸诱导黏附侵袭行为的影响。方法设计和构建带有U6启动子的能产生针对layilin的shRNA的RNA干扰质粒,转染至a549细胞,以RT-PCR、Westernblot和免疫荧光检测a549细胞转染前后layilin表达,以平板黏附模型和Boyden小室模型检测a549细胞转染前后黏附和侵袭能力。结果和转染前相比,转染了RNA干扰表达质粒的a549细胞layilin表达明显减少(P<0.01),而且受透明质酸诱导而黏附于平板和穿过Boyden小室隔膜的a549细胞数皆明显减少(P<0.01)。结论针对layilin的shRNA能明显抑制透明质酸诱导的人肺腺癌a549细胞体外黏附和侵袭能力。

摘要：目的:构建靶向肿瘤坏死因子α(TNF-α)基因的小干扰RNA(siRNA)真核表达载体,观察其对人肺腺癌a549细胞中TNF-α和转化生长因子-β1(TGF-β1)表达的影响。方法:依据GenBank中人TNF-α(NM_000594)序列和siRNA靶序列设计原则,设计并合成一对针对TNF-α的特异性序列(siTNF-α)和一对无关序列(siCon)。退火合成DNA双链,再分别重组入pRNAT-U6.1载体,经过PCR和DNA测序鉴定。将构建好的重组载体pRNAT-U6.1-siTNF-α、pRNAT-U6.1-siCon及空载体pRNAT-U6.1用脂质体介导转染a549细胞株,分别采用RealtimePCR和Westernblot方法检测细胞中TNF-α和TGF-β1mRNA和蛋白的表达水平。结果:PCR和DNA测序鉴定证实载体构建成功;转染pRNAT-U6.1-siTNF-α的a549细胞中TNF-α和TGF-β1mRNA和蛋白表达水平均低于其他3组(FmRNA=478.663,4.081;F蛋白=123.420,6.312,P均<0.05)。结论:成功构建了靶向TNF-α基因的siRNA真核表达载体,该载体能够有效沉默a549细胞中TNF-α的表达,TGF-β1基因表达亦受到抑制。

摘要：目的研究激酶功能区受体(KDR)基因沉默对人肺腺癌a549细胞增殖和对化疗药物厄罗替尼敏感性的影响。方法设计合成KDR的si RNA序列,LipofectamineTM2000转染人a549细胞。RT-PCR和Western印迹检测KDR在干扰后m RNA和蛋白的表达情况,通过流式细胞仪检测细胞周期。MTT法和细胞克隆形成试验观察KDR基因沉默后a549细胞对厄罗替尼的敏感性。结果 KDR基因沉默48 h后,a549细胞的KDR基因和蛋白表达明显降低(P<0.05)。细胞周期被阻滞在G0/G1期,S期细胞数明显减少(P<0.05)。KDR基因沉默组细胞对厄罗替尼的敏感性显著性增强。结论 KDR特异性si RNA能显著沉默a549细胞KDR基因,抑制细胞增殖,并增强a549细胞对厄罗替尼的敏感性。

摘要：目的构建针对细胞周期素D1(cyclinD1,由CCND1基因编码)的shRNA表达载体,筛选出有效序列,观察其对肺腺癌a549细胞增殖的影响。方法设计针对cyclinD1基因编码区的3条寡核苷酸链,体外退火后克隆入干扰载体Pgenesil-1中,对重组质粒进行酶切分析和DNA序列测定。以脂质体法将空载体Pgenesil-1-K和3个重组质粒Pgenesil-1-CCND11、Pgenesil-1-CCND12、Pgenesil-1-CCND13分别导人549肺腺癌细胞,48h后用Real time PCR和Western blotting技术检测各实验组肺腺癌细胞内cyclin D1 mRNA及蛋白的表达情况,用流式细胞仪检测细胞周期观察构建的载体对a549细胞增殖的影响。结果经酶切鉴定及DNA测序,重组质粒中已插入了目的基因片断。转染cyclin D1-shRNA的a549细胞48h后测定cyclin D1 mRNA和蛋白含量,以Pgenesil-1-CCND13抑制cyclin D1 mRNA及蛋白表达效果最为有效,其抑制率分别为62%和60%,而且它能抑制a549细胞的增殖。结论成功构建了针对cyclin D1的RNA干扰表达载体Pgenesil-1-CCND11、Pgenesil-1-CCND12、Pgenesil-1-CCND13,Pgenesil-1-CCND13能有效抑制cyclin D1在a549细胞中的表达,并抑制a549的增殖,为进一步应用于肺腺癌的治疗实验研究奠定了基础.

摘要：目的探讨紫云英苷(AG)联合高压氧(HBO)处理对肺腺癌a549细胞增殖能力的影响及其作用机制。方法a549细胞培养完成后,采用CCK-8法检测其细胞活性,选择100μmol/L为a549细胞的AG作用浓度(IC 50)。按照实验设计分为对照组、AG组、HBO组和AG+HBO组。对照组正常培养;AG组使用100μmol/L AG培养48 h;HBO组将a549细胞用HBO处理2次;AG+HBO组使用100μmol/L AG培养48 h后,再予以HBO处理2次。CCK-8法检测a549细胞增殖能力;平板克隆实验检测a549细胞克隆形成情况。Western blotting实验检测a549细胞P13K/AKT信号通路蛋白的表达水平。结果CCK-8法检测结果显示,AG+HBO组a549细胞相对增殖能力相较于其他3组明显降低(P<0.05)。a549细胞在培养2周后,平板克隆实验检测结果显示,AG+HBO组a549细胞克隆形成率[(28.182±5.982)%]明显低于对照组[(70.182±8.511)%]、AG组[(37.545±3.871)%]明显低于HBO组[(67.182±7.982)%],差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。与其他3组比较,AG+HBO组a549细胞P13K/AKT蛋白相对表达量均明显下调(P<0.05或P<0.01)。结论HBO能够提高a549细胞对AG的药物敏感性,其机制是通过下调P13K、AKT的表达,抑制a549细胞的增殖能力。

摘要：[目的]构建SUSD2基因短发夹RNA(shRNA)的表达载体,并在人非小细胞肺癌(NSCLC)a549细胞中鉴定。[方法]设计合成SUSD2基因shRNA片段,连接到经Bam HⅠ和EcoRⅠ双酶切的psi-m H1 shRNA载体中,构建干扰表达载体psi-m H1-SUSD2 shRNA,酶切后测序鉴定;将干扰载体psi-m H1-SUSD2 shRNA转染a549细胞,荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western Blot法检测干扰载体的干扰效率。[结果]酶切和测序结果显示成功构建了SUSD2基因shRNA的表达载体,q-PCR和Western Blot结果显示最佳干扰载体可使SUSD2 mRNA相对表达量下调75%以上,并可明显抑制a549细胞中SUSD2蛋白的表达。[结论]成功构建了SUSD2基因干扰表达载体,并在a549细胞中有效干扰SUSD2基因的表达。

摘要：目的构建针对Hmgb3的shRNA诱导型慢病毒,检测诱导稳定感染细胞株干扰序列的干扰效率及其对a549细胞增殖的影响。方法设计Hmgb3及对照GFP shRNA序列,装入Tet-pLKO-puro质粒,进行慢病毒包装,感染a549细胞,嘌呤霉素筛选稳定株,筛选最佳诱导浓度并诱导干扰序列表达,Western blot检测干扰效率,MTT实验检测其对a549细胞增殖的影响。结果构建的Hmgb3shRNA慢病毒稳定细胞株诱导后可显著抑制Hmgb3的表达,干扰效率达73%(P<0.05),而对照组无明显干扰效果(P=0.721),对照组的增殖率为94%,实验组的增殖率下降为46%(P<0.05)。结论成功构建了针对Hmgb3的shRNA诱导型慢病毒,并有效沉默a549细胞靶基因,干扰Hmgb3对肺癌细胞的增殖有一定的抑制作用。

摘要：目的构建真核表达质粒pIRES-Rb94,观察Rb94基因对鞘氨醇激酶(SphK)表达的影响。方法根据Rb94基因序列设计、合成引物,构建以内部核糖体进入位点(IRES)相连的Rb94基因的真核表达质粒pIRES-Rb94,经脂质体转染a549细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞株。采用Real-time RT-PCR和Western boltting法检测Rb94基因并观察其对人肺腺癌a549细胞株SphK表达的影响。结果成功构建重组表达质粒pIRES-Rb94,转染a549细胞后获得稳定转染细胞株pIRES-Rb94-a549,该细胞株中Rb94基因高效表达;SphK1表达下调而SphK2表达上调。结论真核表达质粒pIRES-Rb94构建成功并可有效转染a549细胞,Rb94基因抑制SphK1的表达,增强SphK2的表达。

摘要：目的:从氧化应激的a549细胞鉴定Alu RNA表达,构建Alu RNA及其2种功能缺失突变体的真核表达质粒,探讨过表达Alu RNA及其突变体对细胞氧化应激的影响。方法:设计Alu RNA特异性引物,H2O2应激a549细胞,RT-PCR扩增目的片段,通过定向克隆、点突变等方法构建pc DNA3.0-Alu(p Alu)重组质粒、右臂缺失突变体pc DNA3.0-Alu-left arm(p Alu-LA)、G25C突变体pc DNA3.0-Alu G25C(p Alu-M);转染a549细胞,DCFH-DA检测活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)产生水平。结果:从应激的a549细胞成功扩增了Alu分子,重组的真核表达质粒p Alu、p Alu-LA、p Alu-M经酶切及DNA测序鉴定符合预期;p Alu、p Alu-LA转染显著促进a549细胞ROS产生;与p Alu相比,p Alu-M转染诱导产生的ROS显著降低。结论:成功克隆了氧化应激刺激下a549细胞产生的Alu RNA及其2种功能缺失突变体的真核表达质粒,体外实验显示Alu RNA通过翻译水平调控促进a549细胞ROS产生。