摘要：两栖类正经历全球范围内的种群衰退,很多两栖动物集群灭绝事件与环境病原体(如壶菌(batrachochytrium dendrobatidis)的侵扰有关。MHC基因的表达产物在有颌脊椎动物免疫应答过程中起关键作用,其多态性通常与动物对疾病的抗性或易感性密切相关,因而被认为是研究动物适应性进化的最佳候选基因之一。本文对中国特有的无尾两栖动物凹耳蛙(Odorrana tormota)MHC II类b基因多态性进行初步研究。首先,利用1对通用引物扩增出凹耳蛙MHC II类b基因exon2长约180bp的DNA片段。在此基础上,利用ligation-mediated PCR进一步获取侧翼未知序列,序列拼接后长2,030bp,包含exon2以及intron1和intron2的部分序列。基于上述序列设计出凹耳蛙b基因exon2特异性引物(IIQ1bU/IIQ1bD),对该物种黄山种群32个样品进行PCR扩增和克隆测序,共获得34个不同的等位基因,等位基因序列核苷酸和氨基酸变异位点的比例分别为16.17%(33/204)和26.87%(18/67),大多数氨基酸变异位点位于推测的抗原结合位点(antigen binding sites,AbS)。每个样品包含2-5个等位基因,结合等位基因序列特征以及cDNA表达分析结果,推测凹耳蛙至少拥有3个可表达的b基因座位。与文献报道的蛙科其他物种比较后发现,尽管凹耳蛙目前的分布区非常狭窄,但其MHC II类b基因多态性明显高于蛙科其他动物。等位基因碱基替换模式提示凹耳蛙MHC II类b基因曾经历过强烈的正选择作用,AbS区的dN值显著大于dS(P<0.05),PAML软件包CODEML程序中不同模型的似然比检测(likelihood rate test)结果同样支持上述推论,贝叶斯经验贝叶斯路径(bayesian Em-pirical bayes)共检测出5个显著受正选择作用的氨基酸位点。贝叶斯系统树的拓扑结构显示,无尾两栖类不同科的等位基因分别形成单系群,但蛙科不同属的等位基因未能形成单系群,蛙属绿池蛙(Rana clamitans)的1个等位基因与臭蛙属凹耳蛙的部分等位基因享有共同的谱系关系,提示蛙科不同属间的b基因存在跨种多态性。

摘要：为识别和克隆华支睾吸虫新基因 ,对华支睾cDNA质粒文库进行随机筛选并测序 ,并利用在线生物信息学工具进行序列分析 ,识别华支睾吸虫未知基因 ,同时根据PGEX -4T- 1多克隆位点及未知基因的序列设计引物 ,PCR扩增目的基因 ,并构建原核重组质粒。结果发现了Csvpb基因 ,其完整阅读框含 76 2个碱基 ,编码 2 5 4个氨基酸 ,理论分子量为 2 7. 7kDa。序列分析表明 ,Csvpb蛋白与其它物种的卵黄前体蛋白有较高的同源性 ,所构建的重组原核表达质粒PGEX- 4T- 1 vpb经PCR、双酶切及测序证实与目标基因相符。

摘要：据*** 12月9日报道(原载Nature 2004；432：769—774)，人类白细胞抗原(HLA)b类分子在决定HIV病情发展中起着关键作用。这个发现可能对设计预防HIV病毒的疫苗有重大意义。现已知HLA—Ⅰ类分子通过将致病原蛋白释放到被感染细胞表面来使CD8+T细胞聚集。然而，HLA—A和HLA—b在这个过程中各自起多大作用尚不清楚。

摘要：目的:通过对2种三疣梭子蟹居群样线粒体Cyt b和S-rRNA基因片段的序列分析,探讨其遗传变异,为种质资源的管理、保存和利用提供依据.方法:采集山东潍坊和福建厦门两个不同居群的三疣梭子蟹样,提取其线粒体DNA.由Genebank获得三疣梭子蟹完整线粒体DNA序列(登陆号:NC_005037),设计扩增Cyt b和S-rRNA基因片段引物,经PCR扩增获得预期产物,纯化后测序.结果:以提取的线粒体DNA为模板扩增出特异性强的Cyt b和S-rRNA基因片段,与预期条带长度429 bp和465 bp吻合;2个基因片段的AT含量均高于GC含量;Cyt b基因片段有3个位点发生了突变,S-rRNA只有1个位点发生了突变;在两种居群的4个突变位点中,2个位置突变为相同的碱基,且所有突变位点均呈转换方式.结论:Cyt b基因序列比S-rRNA基因序列具有相对高的突变率;研究的2个基因片段的突变位点的碱基置换主要呈转换方式;来自2个三疣梭子蟹居群样本的线粒体S-rRNA基因的突变发生在同一位点且突变为相同碱基,表明2个居群具有较近的亲缘关系.

摘要：建立6种鳗鱼的物种多基因DNA条形码精准鉴定方法。以鳗鱼DNA为模板,采用3对通用引物对6种鳗鱼的3个基因(16S rRNA、Cyt b、COⅠ)部分DNA片段进行聚合酶链式反应扩增、测序,结果6种鳗鱼各获得3条16S r DNA(638~643 bp)、Cyt b(464~466 bp)、COⅠ(705~707 bp)基因部分DNA序列,从中选取各物种序列同源的片段设计3对新引物对6种鳗鱼的16S rRNA、Cyt b、COⅠ基因部分DNA片段进行PCR扩增,其产物大小分别为504~507、400、609 bp,再从各片段中筛选出具有6种鳗鱼物种特异性强的、碱基数分别为262、280、300 bp的3条DNA片段序列,作为6种鳗鱼物种的3个基因的标准DNA条形码,应用DNAMAN V6软件进行同源性分析,并通过Gen bank数据库的比对验证,制定了供检测实践用的同源率判别指标,建立鳗鱼物种的多基因条形码检测方法。应用该方法对30个待检鳗鱼样品进行检测,结果表明,各样品基于3个基因DNA条形码的比对,符合同源率指标,物种判别结果互相吻合,从而精准判别样品的所属物种。该方法稳定、精准、易于操作,可应用于6种鳗鱼的物种鉴定,值得推广。

摘要：目的　了解贵州侗、苗、汉族HbV感染者的基因型。方法　比较 12 7株各基因型HbV全序列S基因核苷酸序列 ,用DNA分析软件筛选出 3个限制性内切酶。设计 3条HbVS区引物并进行聚合酶链反应扩增 ,产物经MboⅠ、bstNⅠ或bsmAⅠ酶切 ,分析酶切产物电泳图谱 ,建立区分HbV(A～F)基因型的方法。对贵州 16 6份侗、苗、汉族HbV感染者血清进行基因分型 ,5份PCR产物直接测序验证分型方法的准确、可靠。结果　S基因PCR RFLP分型结果准确 ,5份酶切鉴定结果经测序证实。 16 6份标本中 ,b基因型 138份 (83 13% ) ,C型 2 8份 (16 87% ) ,未发现b、C以外的其他基因型。侗族的 4 8例中 ,4 7例为b型 (97 92 % ) ,1例C型 (2 0 8% ) ,苗族的 5 2例中 ,4 9例为b型(94 2 3% ) ,3例C型 (5 77% ) ;6 6例汉族也以b基因为主 (6 3 6 4 % ,4 2 6 6 ) ,但C型有 2 4例 (36 36 % ) ,与侗、苗族HbV感染者相比 ,差异有显著意义 (χ2 =35 0 5 88,P <0 0 0 5 )。结论　贵州地区HbV基因型由b、C 2型构成 ,且以b基因型为主。汉族患者C型较多 ,而侗、苗族患者中b型是占绝对优势的基因型。

摘要：目的　建立一种简便、准确的鹿类中药材鹿茸、鹿鞭、鹿筋、鹿胎的DNA分子标记鉴定方法。方法　在对鹿类中药材的正品原动物梅花鹿、马鹿及其混伪品原动物的Cytb基因全序列分析的基础上 ,设计了一对专用于鉴定正品鹿类药材的位点特异性鉴别引物ILu0 1 L和ILu0 1 H。结果　在 6 4℃的复性温度下 ,用鉴别引物对原动物样品进行鉴别PCR ,仅正品能得到约 36 5bp阳性扩增带 ;对鹿茸、鹿鞭及鹿筋正、伪品药材进行PCR鉴定 ,结果表明 :3批鹿茸仅一批为正品 ,2批鹿鞭皆为伪品 ,鹿筋正、伪品药材PCR鉴定与形态鉴定结果一致。随机选取 2枚鹿茸及一个原动物做Cytb基因片段序列分析 ,其结果与PCR鉴定完全一致。结论　对市售鹿类商品药材需加强质量监督和管理。所设计的鉴别引物对梅花鹿、马鹿有高度特异性 ,可应用于以其为原动物的鹿类中药材的鉴定。

摘要：以副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)gyr b基因特异序列为靶序列,设计RNA-DNA组合引物和链终止序列,优化反应体系,建立实时荧光单引物等温扩增(Real-time fluorescence single primer isothermal amplification,实时荧光SPIA)检测副溶血性弧菌的方法。实时荧光SPIA在40 min反应时间内,对3株副溶血性弧菌和16株其他食源性致病菌进行实时荧光SPIA检测,结果表明除3株副溶血性弧菌外,其他细菌均未扩增出荧光曲线。进一步研究表明,实时荧光SPIA检测副溶血性弧菌纯培养DNA的灵敏度为8.2 fg/μL,对副溶血性弧菌菌悬液的检测灵敏度为13.5 CFU/m L;对鳕鱼、海蟹、牡蛎和咸鸭蛋等4种模拟样品中副溶血性弧菌的检出限均为14.7 CFU/g。研究结果表明,实时荧光SPIA检测副溶血性弧菌灵敏度高,特异性强,耗时短,方法简便。

摘要：根据伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,RV)g b基因保守序列,设计合成一套特异引物和Taq Man探针,建立了一种快速、敏感和特异的检测伪狂犬病毒的实时荧光定量PCR方法。该方法可检测到相当于10 copies/μL的病毒DNA,比常规PCR检测方法高约100倍,敏感性较强;该方法检验猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型呈现阴性结果,特异性强;变异系数小于1%,具有良好的重复性。本研究建立的实时荧光定量PCR方法为临床上对伪狂犬病毒的检测和定量奠定了坚实基础。

摘要：为建立一种快速、准确检测黄颡鱼源维氏气单胞菌(***)的方法,本研究根据***菌株RC110724黏附素基因(Aha)和促旋酶b亚单位基因(gyrb)序列设计引物,经条件优化建立了***的双重PCR检测方法。结果显示该方法可以同时扩增出*** 419 bp和745 bp两条特异性的片段,而对嗜水气单胞菌、迟缓爱德华菌、副溶血性弧菌、麦氏弧菌、荧光假单胞菌、金黄色葡萄球菌、柱状黄杆菌、肺炎克雷伯氏菌、无乳链球菌、舒伯特气单胞菌扩增结果为阴性;该方法对***标准株ATCC35624和RC110724基因组DNA和菌体检测下限分别为6.6×10^(-3)ng/μL和3.2×10~2cfu/mL。利用建立的双重PCR方法对30份临床样品进行检测,结果与细菌传统分离鉴定符合率为100%。同时,双重PCR可以检出菌株RC110724人工感染的黄颡鱼肝、脾和肾组织中的细菌DNA,对肝和脾脏组织的样品检测效果最好。本研究建立的双重PCR检测方法特异性好,具有较高的检测灵敏性,可用于黄颡鱼等***感染病例的快速诊断和流行病学监测。