摘要：构建Shcbp1慢病毒干扰载体,探究SHCbP1在黑色素瘤b16细胞中的生物学功能。通过设计靶向干扰小鼠Shcbp1基因的shRNA-1和shRNA-2以及对照序列shRNA-NC,连接至慢病毒骨架载体,利用HEK293T细胞包装慢病毒颗粒,侵染b16细胞,检测干扰效率,并通过CCK-8和流式细胞术检测细胞活力和细胞周期。利用Western blot检测增殖相关基因的表达。结果显示:敲低Shcbp1显著抑制b16细胞增殖;流式细胞术检测结果发现,敲低Shcbp1将b16细胞阻滞在G1期;ERK1/2的磷酸化水平降低,P21的表达水平升高。结果表明SHCbP1可能通过ERK1/2信号通路抑制P21的转录,加速b16细胞从G1到S期进程。

摘要：【目的】获得抗信号转导和转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)蛋白的特异性纳米抗体,通过验证该纳米抗体在免疫组织化学和Western blotting检测中的应用及对黑色素瘤细胞b16生长的作用,对其功能进行鉴定。【方法】通过噬菌体展示淘筛技术从羊驼b16纳米抗体文库中筛选抗STAT3纳米抗体,获得阳性克隆并测序;根据序列信息设计和构建pColdⅠ原核表达质粒,并通过大肠杆菌进行纳米抗体表达;通过镍柱、分子筛和超滤管进行纯化和浓缩;利用免疫组织化学和Western blotting验证纳米抗体是否结合脑组织中STAT3蛋白;采用CCK8法分析该纳米抗体对b16细胞增殖的影响,并用Western blotting检测其对其分子路径相关基因表达的影响。【结果】经过噬菌体展示淘筛及阳性克隆测序后,成功获得1株特异性结合STAT3蛋白的纳米抗体单克隆菌株,命名为STAT3-VHH-10b;将构建的该纳米抗体的pColdⅠ原核表达载体进行诱导表达和纯化,SDS-PAGE结果显示,成功得到大小约为15 ku的抗STAT3纳米抗体;免疫组织化学和Western blotting结果显示,纯化制备的纳米抗体可成功检测到大脑组织中STAT3的表达;细胞增殖检测结果显示,该纳米抗体对b16细胞增殖具有明显的抑制作用,并下调细胞增殖路径的主要基因CycD 1、bcl2、cMyc编码蛋白的表达。【结论】本研究成功筛选到1株抗STAT3蛋白的特异性纳米抗体,且该纳米抗体可用于免疫组织化学和Western blotting法检测组织中STAT3的表达,此外,通过与抗原结合后,抑制主要基因CycD 1、bcl 2、cMyc的表达,从而抑制b16细胞增殖。本研究结果将为STAT3及其纳米抗体的功能研究提供新工具。

摘要：通过Genbank数据库检索,基于小鼠MMP-9基因设计特异性的siRNA干扰靶点,克隆至pGCsi-U6/Neo/GFP载体中,使用PEI衍生物包裹,转染小鼠黑色素瘤b16细胞,流式细胞仪和激光扫描共聚焦显微镜分析细胞转染情况,RT-PCR检测24,48 h后MMP-9基因转录水平变化,筛选最佳的重组质粒和干扰靶点。结果显示:成功设计和构建了3个MMP-9-siRNA干扰质粒,3个重组质粒对b16细胞的转染率分别为60.04%、63.93%和56.27%,且3个重组质粒均能有效干扰b16细胞MMP-9 mRNA的表达,其中MMP-9-siRNA-2干扰效率最高(63%),可持续干扰MMP-9基因表达。这些结果提示,MMP-9-siRNA-2为沉默小鼠黑色素瘤细胞MMP-9基因最优的siRNA重组质粒。

摘要：我们利用从莪术油中分离得到的莪术醇考察对b16细胞黑色素的影响,发现其对黑色素有抑制作用。为了进一步对莪术醇的化学结构进行修饰,设计合成了8个莪术醇的衍生物,其中2、3、5a、5b、6为新化合物。经筛选发现两个衍生物5b和6抑制黑色素含量比莪术醇有所增强,但并无较大的显著性差异,经Grphpad prism软件分析,其P值均大于0.05,分别为0.80和0.22。黑色素含量测定结果表明莪术醇环外双键经环氧化、水解及酯化后可提高其抑制黑色素含量。