摘要：建立了一种用PCR方法筛选富含高度重复序列的大麦bacDNA文库和直接对bacDNA进行末端测序的方法。用PCR技术进行大麦bacDNA文库 (含 816个平板 ,每个平板含 384个克隆 )的筛选分 4步进行。在实验中 ,建立了两个水平的bacDNA池 (一级池和二级池 )。一个二级池由一个平板 (含有 384个克隆 )的DNA组成 ,一个一级池由连续 10个稀释 10 0倍的二级池的DNA混合而成 (如 1～ 10 ,11～ 2 0等 ) ,共 82个一级池。bacDNA文库筛选的第一步是对 82个一级池的筛选。得到阳性一级池后 (如 2号一级池 ) ,对其所含的 10个二级池 (从 11～ 2 0 )进行第二步筛选。得到阳性二级池后 ,培养相应的阳性平板的所有克隆 (384个 ) ,从头开始 (左上侧 ) ,每相邻的 4个克隆为一组 ,在 96孔板上 (4X 96 =384 )进行第三轮PCR反应 ;之后对筛选结果为阳性的 4个克隆分别进行菌落PCR(第四轮 )得到单一阳性克隆。根据bacDNAHindIII酶切指纹图谱 ,对同一引物筛选的bacs进行重叠群作图 (Contig)。对代表contig的两端的bacDNA直接进行末端测序并对测序结果Blast,以检测其在大麦中是否属于单拷贝序列。根据测序和Blast结果设计引物 ,用中国春附加系 (附加大麦染色体 )对来自bac克隆的引物进行染色体定位并用分离群体进行遗传学作图 ,以确定是否?

摘要：以云南紫稻细胞质无花粉型水稻樱香不育系和保持系为材料，构建了不育系和保持系的线粒体基因组bac文库．每个文库均保存2304个菌落，外源插入片段介于10～20kb之间．将两个文库的2304个克隆分别集中于96孔板中，根据已发表的水稻线粒体序列对atp6、atp9、cob、cox2等4个基因设计特定引物，对96孔板中的菌落进行了PCR鉴定，均能筛选得到阳性克隆，通过对96孔板中阳性克隆的位置进行推导，可以得到文库中含有相应基因克隆的大致位置及数目．PCR筛选结果显示两个文库均包含用于检测的目的线粒体基因，说明文库典型性良好，并且PCR法用于文库基因筛选具有快速简便的优点．

摘要：樟树(Cinnamomum camphora(L.)Presl)是一种具有材用、药用、油用、香料和生态环境建设等多种用途的樟科植物代表种。本研究以樟树幼嫩叶片为材料,通过提取高分子量核DNA(HMW-DNA)构建了第一个樟树细菌人工染色体(bac)文库。该文库一共有36 960个克隆,平均插入片段为120 kb,覆盖樟树全基因组5.7倍左右,空载率小于1%。随机挑选10个bac克隆进行末端测序说明bac克隆为正常可用的单克隆。以此为基础,对樟树的bac文库进行了测序,最终得到287.28 G的数据。樟树基因组bac文库的构建,为樟树重要功能基因的克隆、功能验证、物理图谱的构建和全基因组测序等研究工作奠定了基础。

摘要：目的从东方田鼠的部分bac文库中筛选微卫星。方法应用非放射性的菌落杂交方法和磁珠富集法从东方田鼠的bac文库中筛选高质量的微卫星标记。结果以地高辛标记的寡聚核苷酸(CA)20为探针,通过菌落杂交法从136个东方田鼠bac克隆中筛选出杂交信号最强的20个阳性克隆。再将这20个阳性克隆分别通过链霉亲和素磁珠法构建亚克隆文库,从中选取400个经PCR鉴定为阳性的亚克隆进一步测序分析,共得到220个微卫星序列,阳性率55%。选取重复次数高,侧翼序列完整的微卫星序列设计74对引物,共有35对引物能扩增出清晰的条带,其中16对引物具有多态性。结论成功且高效地从阳性bac克隆中筛选出微卫星序列,这些微卫星和阳性bac克隆可用于后续的定位研究。

摘要：苏云金芽胞杆菌幕虫亚种YBT-020具有典型的晶胞粘连表型。在前期的研究中,通过质粒消除实验,推测晶胞粘连现象与YBT-020内生质粒pBMB28有关。为了定位质粒pBMB28上控制晶胞粘连表型的基因,首先对质粒pBMB28进行克隆。利用穿梭载体pEMB0557,成功构建了苏云金芽胞杆菌YBT-020的基因组人工染色体(bac)文库。前期的研究表明晶体蛋白基因cry28Aa定位在质粒pBMB28上,根据cry28Aa基因序列设计引物,从文库中筛选到含有cry28Aa的重组质粒pBMB231。镜检和SDS-PAGE证明质粒pBMB231转化无晶体突变株BMB171形成的重组子BMB231可以产生Cry28Aa晶体蛋白,但不能恢复晶胞粘连表型。对重组质粒pBMB231的插入片段末端序列测定并设计引物筛选文库,通过染色体步移方式得到4个可以重叠覆盖质粒pBMB28不同区域的克隆子,从而克隆了该质粒。对这4个克隆子末端测序和酶切分析,测算出该质粒的大小约为140 kb。进一步确定应用基因组bac文库以及重叠片段筛选的方法,可以快速有效的克隆苏云金芽胞杆菌大质粒。

摘要：以pBelobac11为载体,成功构建了苏云金芽胞杆菌YBT-1765的基因组人工染色体(bac)文库和质粒bac文库。根据已克隆的包含复制子ori165在内的3.6kb片段中编码复制蛋白Rep165的核苷酸序列设计探针,通过染色体步移方式,对质粒文库和基因组文库进行筛选,得到13个覆盖YBT-1765菌株中质粒pBMB165不同区域的克隆子。通过HindⅢ和BamHⅠ酶切分析,建立了质粒pBMB 165的物理图谱和线状重叠连锁图,并测算出该质粒的大小为82kb。根据部分核苷酸序列初步统计了pBMB 165上转座因子的存在机率。YBT-1765菌株基因组文库的构建和物理图谱的绘制为克隆苏云金芽胞杆菌大质粒提供了一套可行的方案,成功解决了大质粒难克隆的问题。

摘要：根据植物葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH,EC1.1.1.49)氨基酸保守区域,设计简并引物,采用RT-PCR技术克隆得到甜瓜属野生种Cucumis hystrix Chakr.(2n=24)G6PDH基因cDNA片段;随后基于该序列设计特异引物,PCR方法筛选野生种bac文库,获得2个bac阳性单克隆。测序后获得了G6PDH基因全序列及其上游启动子序列,GenBank登录号:JQ771576。序列分析显示:G6PDH基因全长约6.5 kb,由15个外显子和14个内含子组成;内含子序列均符合5'-gt-ag-3'结构。外显子拼接后获得了G6PDH基因的开放阅读框(ORF)序列,序列全长1 551 bp,编码516个氨基酸,与黄瓜基因组网站公布的G6PDH基因核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为98.71%和99.03%。野生种G6PDH氨基酸序列N端缺少转运肽序列,确定为野生种胞质G6PDH。氨基酸序列与烟草、马铃薯、荷兰芹、猕猴桃、拟南芥、大豆、小麦、玉米、葡萄、杨树等植物胞质G6PDH同源性高达77%以上。系统发育树分析发现,甜瓜属胞质G6PDH与茄科植物最先聚类,植物胞质G6PDH在分子进化水平上与物种进化相符。启动子结构分析表明:序列含有启动子基本元件TATA-box、CAAT-box,还含有丰富的光响应元件,与环境胁迫响应相关的不同顺式作用元件,促进高水平转录的5UTR Py-rich stretch元件和提高表达的CAT-box元件等。

摘要：以本实验室构建的半滑舌鳎bac文库为基础,通过对其进行有序混合,构建了两步PCR筛选体系;对性别决定相关的sox9基因的序列设计特异性引物,筛选获得阳性单一bac克隆。利用bac-FISH技术将包含sox9基因的bac克隆定位在半滑舌鳎染色体上。结果显示,sox9基因在雌、雄半滑舌鳎的一对常染色体的长臂上分别存在两个杂交信号位点,信号稳定且特异。研究证实了该文库筛选体系的有效性;首次实现了对性别相关的sox9基因在半滑舌鳎染色体上的定位,其结果为揭示sox9基因参与鱼类性别控制的机制提供了重要基础。

摘要：Amelogenin基因是控制牙釉蛋白的表达基因。它不仅在动物牙齿发育过程中起重要的调控作用,而且可用于动物性别鉴定。为了获得绒山羊Amelogenin基因全序列、研究绒山羊牙齿的进化过程、实施牙齿保护,本研究根据GenBank收录的绵羊Y染色体基因Amelogenin-intron4序列设计引物,以绒山羊基因组DNA为模板,通过PCR技术,进行绒山羊bac文库Amelogenin筛选与克隆。测序后得到259bp的目的序列。此片段与其他物种进行核苷酸序列比对,结果显示,与绵羊、牛同源性分别达98%和96%,而与人、黑猩猩、老鼠无同源性。属于GT-AG型内含子,具有增强Amelogenin基因转录的作用,并且通过实验筛选出该片段所在的bac为山羊Y染色体的bac。