摘要：目的构建针对人bag-1(Bcl-2-associated athanogene 1)基因的短发卡RNA(short hairpinRNA,shRNA)真核表达质粒,探讨其对人胃癌SGC-7901细胞bag-1主要亚型表达的抑制作用及对细胞生长的影响。方法以人bag-1 mRNA编码区为RNA干扰靶点,设计2条不同的位于bag-1基因P29、P33、P46、P50亚型的两个通用外显子上64nt寡核苷酸干扰片段A、B及1条阴性对照片段S,将其定向克隆到带有卡那霉素抗性和增强绿色荧光蛋白的真核表达载体pGenesil-1上,将其转染至SGC-7901细胞中,设空白对照组(未转染质粒SGC-7901-Un)、阴性对照组(转染阴性对照质粒pGensil-Neg)、干扰组(转染干扰质粒pGensil-bag1-A和pGensil-bag1-B),用RT-PCR、Western blot检测bag-1基因的干扰效果。MTT法检测细胞生长情况并绘制生长曲线。结果酶切及测序结果证实,pGensil-bag1-A和pGensil-bag1-B干扰质粒及阴性对照质粒pGensil-S构建成功。质粒在SGC-7901细胞中的转染效率达40%～50%。阴性对照组细胞bag-1基因表达与空白对照组无明显差异,干扰组细胞bag-1基因表达较空白对照组显著下降(P<0.01),表达抑制率在mRNA水平为(63±9.8)%,在蛋白水平对bag1-P46、bag1-P32亚型的抑制率分别为(94.3±1.08)%、(66.1±6.5)%。生长曲线表明细胞生长受到了抑制。结论针对人bag-1基因的shRNA真核表达质粒pGensil-bag1-A和pGensil-bag1-B共转染能高效特异的抑制胃癌SGC-7901细胞中bag-1主要亚型的表达,并抑制人胃癌SGC-7901细胞的生长。

摘要：【目的】明确斜带石斑鱼(Epinephelu coioides)bag-1基因(Ecbag-1)的结构特征、组织表达分布及在脂多糖(LPS)和聚肌胞苷酸(PolyI:C)刺激后的表达变化,进一步揭示鱼类bag-1在病原感染中的作用机制,也为了解鱼类的抗病免疫提供参考依据。【方法】依据Ecbag-1基因EST序列设计特异性引物克隆Ecbag-1基因,通过SMART、TMHMM Server v.2.0、SOPMA、SWISS-MODEL、ExPASy、ClustalX及MEGA 5.0等在线软件进行生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR检测Ecbag-1基因的组织表达特征及其在LPS和PolyI:C刺激后的表达模式。【结果】克隆获得的Ecbag-1基因开放阅读框(ORF)长624 bp,共编码207个氨基酸残基;Ecbag-1蛋白分子量为49.84 kD,理论等电点(pI)为5.18,为疏水性蛋白。Ecbag-1蛋白具有bag-1家族保守的bag结构域和UBQ泛素相关结构域,无跨膜结构域,主要分布在细胞质和细胞核,其二级结构中α-螺旋占65.22%、延伸链占10.63%、无规则卷曲占20.29%、β-转角仅占3.86%。Ecbag-1氨基酸序列与大黄鱼的bag-1氨基酸序列相似性最高(96.62%),亲缘关系最近;与原鸡和热带爪蛙的亲缘关系相对较远,对应的bag-1氨基酸序列相似性分别为58.45%和57.50%。Ecbag-1基因在斜带石斑鱼的肝脏、胸腺、脾脏、头肾、鳃、皮肤、肌肉、大脑、外周血淋巴细胞及心脏等组织中均有表达,且以在大脑中的相对表达量最高,显著高于在其他组织中的相对表达量(P>0.05,下同);经LPS和PolyI:C刺激24 h后,斜带石斑鱼脾脏中的Ecbag-1基因相对表达量显著上调。【结论】Ecbag-1蛋白含有bag-1蛋白家族典型的bag结构域和UBQ结构域,具有与哺乳动物bag-1相似的生物学功能,即Ecbag-1基因在斜带石斑鱼抵御细菌/病毒感染的过程中发挥重要作用,为深入了解鱼类的抗感染机理拓宽了思路。