摘要：目的:检测骨形成发生蛋白9 (bone morphogenetic proteins 9,bmp9)对人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs)的成骨诱导分化能力,并探讨p38 MAPK通路在该成骨分化中的作用。方法:培养h PDLSCs,腺病毒载体(Ad-bmp9)感染hPDLSCs后,通过碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性测定与染色、定量聚合酶链反应(quantitative polymerase chain reaction, qPCR)、钙盐沉积等方法,分别检测ALP、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、骨钙素(osteocalcin, OCN)的表达及钙盐沉积量,评价bmp9诱骨分化的能力。在Ad-bmp9感染hPDLSCs 36 h后,检测bmp9作用hPDLSCs后对p38及MKK3/6磷酸化(p-p38, p-MKK3/6)的影响,以及p38 MAPK通路抑制剂SB203580预处理后bmp9-p38-MAPK通路对hPDLSCs成骨分化的影响。采用SPSS16.0软件包对数据进行统计学分析。结果:在Ad-bmp9作用下,ALP活性、OPN和OCN的表达均显著高于对照组(P<0.01), ALP染色与钙盐沉积结果与之吻合。Western印迹法检测发现,bmp9可增强p-p38、p-MKK3/6的表达。加入p38 MAPK通路抑制剂后,ALP、及OPN、OCN的表达均显著降低(P<0.01),钙盐沉积、基质矿化也显著减弱。结论:在hPDLSCs的分化过程中,bmp9对其具有诱骨分化能力。MKK3/6-p38 MAPK通路参与了该成骨分化过程且具有正向调节作用。

摘要：目的运用CRISR/Cas9技术敲除小鼠基因组中bmp9基因片段,构建bmp9基因敲除小鼠。方法根据bmp9基因的外显子序列,设计一段sgRNA并合成。sgRNA体外转录后和Cas9mRNA混合后显微注射受精卵细胞,注射后的受精卵细胞移植至受体动物获得子代小鼠。提取子代小鼠基因组DNA测序鉴定其基因型。基因型鉴定正确的小鼠与野生型交配后筛选纯合子小鼠。同时取纯合子小鼠心脏、肝、脾、肺、肾,匀浆后提取总RNA和总蛋白,通过qPCR、WB和免疫组化检测bmp9在各组织中的表达。结果设计并合成20bp的sgRNA并进行体外转录,显微注射并回植后得到基因突变小鼠,连续交配后得F2代纯合子。测序结果显示,突变小鼠存在两种基因型,一种为5bp缺失突变,另一种为13bp缺失并伴有1bp插入突变。与野生型C57BL/6相比,qPCR、WB和免疫组化结果均表明基因敲除小鼠肝中bmp9表达显著降低。结论利用CRISPR/Cas9技术成功构建出了bmp9基因敲除小鼠。