摘要：目的探讨自噬标志基因beclin1过表达对黑素瘤SK-MEL-2细胞生物学行为的影响。方法Western印迹技术检测黑素瘤细胞A375、SK-MEL-2中beclin1的蛋白表达水平,选取低表达beclin1蛋白的SK-MEL-2细胞株作为研究对象,将细胞分为空白组、阴性对照组、实验组,空白组不作处理,阴性对照组转染pcDNA.3.1/myc-His(-)A,实验组转染pcDNA3.1-beclin1质粒。培养一定时间后,采用CCK8法分析beclin1对细胞增殖的影响;Transwell实验和细胞划痕实验观察beclin1过表达对SK-MEL-2细胞侵袭和迁移能力的影响。采用重复测量方差分析和完全随机设计方差分析检验各组间的指标差异,组间比较采用LSD-t检验。结果SK-MEL-2细胞beclin1蛋白相对表达水平(0.037&#177;0.010)显著低于A375细胞(0.670&#177;0.150),F=46.62,P<0.05。实验组beclin1蛋白相对表达水平(0.32&#177;0.04)显著高于阴性对照组(0.06&#177;0.02)和空白组(0.07&#177;0.02),均P<0.05。CCK8实验结果显示,不同组间、不同时间细胞增殖率差异均有统计学意义(F组间=1077.36,F时间=4903.04,均P<0.05),组别和时间之间有交互作用(F交互=205.20,P<0.05)。Transwell实验显示,24 h后实验组高倍(15;200)视野下穿过小室的细胞数(18.67&#177;1.19)明显低于阴性对照组(87.89&#177;6.05)和空白组(86.78&#177;5.93),均P<0.05;划痕实验中24、48 h时实验组细胞迁移距离均显著低于空白组和阴性对照组(P<0.05)。结论beclin1过表达可显著抑制SK-MEL-2细胞的增殖、侵袭和迁移。

摘要：目的探讨beclin1基因对缺氧缺糖/复氧复糖小鼠海马神经元细胞系HT22细胞凋亡的影响。方法取对数生长期的HT22细胞,随机分为4组:正常组(normal)、缺氧缺糖/复氧复糖(OGD/R)模型组(model)、beclin1基因沉默组(beclin1^-/-)、转染对照组(control)。除normal组外,其余各组细胞均在缺氧缺糖6 h后进行复氧复糖。利用RNAi技术,针对小鼠c DNA序列设计beclin1干扰序列,用脂质体Lipo2000包裹后转染至HT22细胞。于转染48 h后用荧光显微镜观察转染效率,Western blotting检测细胞beclin1表达情况。各组细胞均于复氧复糖24 h后采用CCK-8法检测细胞活力,乳酸脱氢酶(LDH)法检测细胞损伤情况,免疫荧光染色检测Bax、Bcl-2表达及比值变化,Western blotting检测LC3、P62及Caspase-3表达。SPSS 19. 0统计学软件进行数据分析。结果与normal组相比,model组细胞活力及P62蛋白表达显著降低(P<0. 01),乳酸脱氢酶(LDH)漏出率、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Caspase-3表达及Bax/Bcl-2均显著升高(P<0. 01)。与model组相比,beclin1^-/-组细胞活力及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达显著降低(P<0. 01),LDH漏出率、Bax/Bcl-2及P62、Caspase-3表达显著升高(P<0. 01);control组与model组比较差异无显著性。结论沉默beclin1抑制细胞自噬可使缺氧缺糖/复氧复糖处理的HT22细胞损伤加重,细胞凋亡进一步增加。

摘要：目的探讨抑制自噬基因beclin1表达对舌鳞状细胞癌(以下简称舌鳞癌)细胞增殖及侵袭转移的影响,了解舌鳞癌侵袭转移的调控机制。方法利用RNAi技术,针对人cDNA序列设计beclin1干扰序列,用脂质体Lipo2000包裹后转染至舌鳞癌UM2细胞。实验设空白对照组、脂质体2000(Lipo2000)组、阴性siRNA组和beclin1siRNA组,通过蛋白印迹法检测beclin1、LC3的表达变化;CCK-8法检测细胞增殖能力变化;Transwell小室检测细胞迁移和侵袭能力改变;SPSS13.0统计软件进行数据分析。结果转染beclin1siRNA对UM2细胞beclin1有显著敲减作用(P<0.05),自噬标记蛋白LC3-Ⅱ的表达明显降低(P<0.05),细胞增殖较对照组增快(P<0.05),细胞迁移和侵袭转移能力明显增强。结论沉默beclin1表达可下调舌鳞癌细胞自噬水平,并促进舌鳞癌细胞增殖和侵袭能力。

摘要：采用富阳离子多肽诱导重组蛋白自组装为纳米粒策略有望保持蛋白药物的活性、生物相容性,同时延长其半衰期、提高靶向性,有广泛的应用前景。维持蛋白质药物(尤其是具有多个半胱氨酸残基的蛋白质)在自组装纳米粒中的活性结构对于该类药物的研究至关重要。该研究设计了具有多个游离半胱氨酸残基的重组蛋白CRGDC-T22-TAT-beclin1-GFP-RGDKG-His tag及其对照蛋白序列,构建表达载体、获得大肠杆菌Trans B(DE3)工程菌。该研究分析了非变性条件和变性条件下进行Ni-NTA亲和层析纯化的差异。在变性条件下纯化获得重组蛋白,经复性后得到自组装蛋白质纳米粒,采用动态光散射法测定蛋白纳米粒粒径,使用酶标仪分析重组蛋白的荧光特性,用CCK-8法测定蛋白质纳米粒抑制MCF-7细胞生长的活性。结果显示,重组蛋白CRGDC-T22-TATbeclin1-GFP-RGDKG-His tag形成的纳米粒粒径为(45.13&#177;5.78)nm;其荧光最大发射波长为510 nm,与野生型GFP相同;浓度为10μmol/L的重组蛋白与人乳腺癌细胞MCF-7共同孵育48 h,可将细胞活力降低至31.00%&#177;1.13%。以上结果表明,相比于非变性纯化法,采用变性-复性法可以纯化具有多个半胱氨酸残基的重组蛋白,获得具活性的自组装蛋白质纳米粒。

摘要：beclin1基因与酵母自噬基因Atg 6同源,是参与哺乳动物自噬体形成,调控细胞自噬过程的重要基因.beclin1自噬基因的缺陷可能导致肿瘤细胞逃避自噬性死亡[1],而稳定转染beclin1后可促进细胞的自噬活性,并降低了其成瘤能力[2].本研究观察沉默胰腺癌MiaPaCa-2细胞的beclin1基因表达后对其增殖、凋亡及细胞周期分布的影响,为胰腺癌的基因治疗提供新的思路. 一、材料与方法 1.靶向beclin1的siRNA表达载体构建：根据siRNA设计原理,由上海吉玛制药技术有限公司构建3个插入靶向beclin1基因的siRNA（beclin1-siRNA）质粒以及阴性对照siRNA（NC-siRNA）质粒和荧光标记的siRNA（FAM-siRNA）质粒.经筛选后选择沉默效果最好的beclin1-siRNA序列插入表达载体U6/Neo,构建表达载体U6/Neo-shbeclin1,同时构建阴性对照载体pGPU6/Neo-shNC及荧光对照载体pGPU6/GFP/Neo-shNC.