摘要：[目的]建立荧光实时定量RT—PCR（FQRT—PCR）检测bmi—1基因mRNA的方法并研究该基因在急性白血病细胞中表达的意义。[方法]根据Genbank提供的序列，设计目的基因bmi-1及内参基因GAPDH的扩增引物，将bmi-1及GAPDHRT—PCR扩增片段克隆入载体pMDl8-Tsimple，经测序鉴定正确后，进行纯化、定量及系列稀释，应用SYBRGreenI荧光染料，建立检测bmi-1mRNA的FQRT—PCR方法，并对其线性及特异性进行评价。应用此方法检测21例急性白血病及10例健康人外周抗凝血中bmi-1mRNA的表达水平。【结果]该方法的线性范围为1．0×10^3-1．0×10^8eopies／txL，相关系数为-1．00，熔解曲线分析扩增产物显示单-的峰，熔解温度（Tm）为80．4℃。急性白血病患者的相对表达量为0．56±0．12，健康对照组中bmi-1mRNA的相对表达量为0．19±0．08，两者的表达差异有统计学意义（P〈0．05）。[结论]实时荧光定量RT—PCR方法检测bmi-1基因表达，具有高敏感性和高特异性等优点，可作为进-步研究bmi-1基因的方法。bmi-1基因参与急性白血病的发生，可能是一种新的肿瘤标志物。

摘要：目的探讨慢病毒靶向沉默bmi-1基因对鼻咽癌细胞CNE2生物学行为的影响。方法设计3条bmi-1shRNA干扰系列,构建慢病毒重组载体PLVx-shRNA2-bmi-1,用重组载体转染293T细胞,收集上层病毒液浓缩、滴定。将CNE2细胞随机分为5组,对照组不进行感染,shRNA1、2、3组分别感染表达shRNA1、2、3的慢病毒,空载体组感染空载的慢病毒。感染48 h,用RT-PCR及Western blotting法分别检测bmi-1基因及蛋白的相对表达量,筛选沉默bmi-1效率最佳的干扰序列。用平板克隆形成实验检测bmi-1基因沉默后CNE2细胞增殖能力,用流式细胞术检测细胞凋亡率和周期分布。结果插入的序列与设计的3条shRNA序列碱基排列一致,说明目的片段均已正确插入,PLVx-shRNA_2-bmi-1慢病毒表达载体构建成功。与其他两组比较,bmi-1-shRNA1、2、3组bmi-1 mRNA及蛋白相对表达量低(P均<0.05),bmi-1-shRNA3组最低(P均<0.05),沉默效率最佳。与空载体组比较,bmi-1-shRNA3组增殖能力弱(P均<0.05),细胞凋亡率高(P均<0.05),bmi-1-shRNA3组G1期细胞比例高、S期细胞比例低(P均<0.05)。结论沉默bmi-1基因可抑制鼻咽癌CNE2细胞增殖、促进其凋亡,并改变细胞周期。

摘要：背景与目的:B细胞特异性的莫洛尼白血病毒插入位点1(B-cell-specific Moloney leukemia virus insertion site 1,bmi-1)期在放疗后DNA损伤中发挥重要作用。该研究采用siRNA干扰技术降低食管癌TE13细胞中bmi-1基因表达,探讨bmi-1的表达对X射线照射后食管癌细胞放射敏感性的影响。方法:针对bmi-1 mRNA序列,3对有效的干扰序列(siRNA1、siRNA2和siRNA3)和阴性对照序列由公司设计合成,瞬时转染食管癌TE13细胞,命名为bmi-1 siRNA1、bmi-1 siRNA2和bmi-1 siRNA3共3组,转染阴性对照序列组命名为NC组,未转染组命名为对照组。采用反转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)和蛋白[质]印迹法(Western blot)检测TE13各组中bmi-1在mRNA和蛋白水平的表达。采用MTT法检测bmi-1基因转染对TE13细胞增殖能力的影响。克隆形成实验检测bmi-1对TE13放射敏感性的作用。流式细胞术测定siRNA干扰bmi-1基因对细胞周期和凋亡分布的影响。RT-PCR和Western blot检测细胞内p16、CDK4基因和蛋白表达水平。结果:3对干扰序列使人bmi-1基因在mRNA和蛋白表达水平低于对照组和NC组,尤以siRNA3组效果最明显。选择siRNA3作为干扰组进行MTT和流式细胞术。MTT结果表明,bmi-1 siRNA3转染后bmi-1的低表达对细胞的增殖能力无明显影响;克隆形成实验的结果显示,空白对照组、NC组、干扰组的D_0分别为2.514、2.506和1.761 Gy;D_q值分别为2.694、2.664和2.122 Gy;外推数N值分别为2.920、2.895和3.336;SF2值分别为0.826 8、0.823 1和0.625 5,可见对照组和空载组间放射敏感性差异无统计学意义(P>0.05),而干扰组细胞的放射敏感性高于对照组和NC组;流式细胞术分析显示,6 Gy照射后,bmi-1 siRNA组G_0/G_1期比例明显高于对照组和空载组,G_2/M期显著低于对照组和NC组,而未照射时bmi-1的低表达对细胞周期无明显影响。干扰bmi-1基因后TE13细胞p16基因和蛋白水平升高(P<0.01),CDK4基因和蛋白表达水平显著降低(P<0.01)。结论:siRNA干扰技术有效地抑制了食管癌细胞TE13中bmi-1基因的表达,联合X线照射后显著消除了细胞周期在G_2/M期的阻滞,增加了食管癌的放射敏感性,其诱导作用与p16和CDK4基因和蛋白表达有关。

摘要：目的 采用siRNA干扰技术降低食管癌ECA109细胞bmi-1基因表达,观察其对放射线照射后细胞增殖、迁移能力及周期和凋亡影响.方法 针对bmi-1 mRNA序列,设计合成有效的干扰序列命名为bmi-1 siRNA组,阴性对照序列命名为NC组,未转染组命名为对照组.采用RT-PCR和蛋白印迹法检测ECA109中bmi-1在mRNA和蛋白水平的表达;Transwell小室实验检测siRNA干扰bmi-1基因对ECA109迁移能力的影响;MTT、流式细胞术和克隆形成实验检测bmi-1对ECA109放射敏感性的研究.结果 照射后bmi-1 siRNA组bmi-1基因mRNA和蛋白水平显著低于对照组和空载组,且细胞增殖和迁移能力显著降低（P=0.024、0.000、0.025、0.031）.克隆形成实验显示对照组、NC组放射敏感性相近（P=0.569）,而bmi-1 siRNA组细胞放射敏感性高于对照组和空载组（P=0.000）.流式细胞术分析显示照射后,bmi-1 siRNA组G2＋M期显著低于对照组和空载组（P=0.000）;且细胞凋亡显著增加（P=0.000）,而未照射组之间未见明显差异（P=0.350）.结论 siRNA干扰联合X线照射有效降低食管癌细胞ECA109中bmi-1基因表达,进而抑制亚致死性损伤修复而增加放射致死效率.

摘要：本研究构建bmi-1基因的shRNA慢病毒表达载体,建立U266-li稳定细胞株,为下一步bmi-1的功能研究及应用RNAi技术治疗打下基础。设计、合成1对针对bmi-1 mRNA的shRNA序列,退火后连接到pLVTHM干扰载体上,与psPAX2、PMD2G共转染HEK 293T细胞,包装产生慢病毒颗粒并测定病毒滴度,感染U266细胞,建立稳定细胞株;应用实时PCR和Western blot技术分别检测U266稳定细胞中bmi-1及P14 mRNA和蛋白水平的表达,并与对照组进行比较。结果表明,成功构建了针对bmi-1基因的shRNA慢病毒表达载体,病毒滴度为5×107 TU/ml;建立稳定转染的U266细胞株。有效干扰验证显示,shbmi-1能明显降低bmi-1的mRNA及蛋白水平,而P14的mRNA及蛋白水平则都上调,其差异有统计学意义(P<0.05)。结论:成功构建bmi-1基因的shRNA慢病毒表达载体,建立稳定干扰bmi-1表达的U266细胞株。

摘要：背景与目的:原癌基因bmi-1是多梳基因家族中的一员,能调节正常干细胞和肿瘤干细胞的自我更新能力。近年来发现其在多种恶性肿瘤中表达上调。本文旨在观察bmi-1基因沉默对肺腺癌A549细胞体内外增殖的影响,并初步探讨其机制。方法:根据本实验室设计的4条针对bmi-1的小干扰RNA(siRNA)序列,选择一条已经证实最有效的序列作为靶序列和一条随机序列作为阴性对照,构建重组逆转录病毒siRNA表达载体并将其转染入A549细胞中;应用RT-PCR和蛋白质印迹法(Western blot)检测对bmi-1基因的沉默效果;应用MTT比色法、台盼蓝拒染法及平板克隆形成实验检测bmi-1-siRNA对A549细胞体外增殖的影响;利用流式细胞仪分析各组细胞的细胞周期;通过裸鼠腋窝皮下接种各组细胞,观察bmi-1-siRNA对A549细胞在裸鼠体内的致瘤能力的影响;Western blot检测PTEN、p-AKT、cyclin D1、P21、P27蛋白表达。结果:bmi-1-siRNA有效地沉默了bmi-1基因mRNA和蛋白的表达;沉默bmi-1基因的表达能够抑制A549细胞的体内外增殖能力,使干扰组细胞的细胞周期阻滞于G1期;沉默bmi-1基因的表达后,干扰组细胞中PTEN、P21、P27蛋白增加,p-AKT、cyclin D1蛋白表达降低。结论:bmi-1-siRNA通过使细胞周期阻滞于G1期来抑制肺腺癌A549的体内外增殖能力,这种抑制作用涉及cyclin D1和p-AKT表达下降以及P21/P27和PTEN的表达上调。

摘要：目的构建针对原癌基因bmi-1的shRNA逆转录病毒表达载体,建立稳定转染的LoVo细胞系,探讨稳定转染bmi-1shRNA对大肠癌细胞LoVo靶基因表达的影响,为下一步应用RNAi技术治疗打下基础。方法设计合成靶向bmi-1基因编码短发夹RNA的两条寡核苷酸序列,另设计无义对照序列,构建重组载体pSIREN-bmi-1及pSIREN-bmi-1-C,载体经脂质体2000介导转染LoVo细胞,通过嘌呤霉素筛选,建立稳定转染的LoVo细胞系,显微镜观察、MTT检测、荧光定量PCR、Western blot检测bmi-1表达受抑后对细胞的增殖影响。结果成功构建了针对bmi-1基因的shRNA表达载体,建立了稳定转染的LoVo细胞系,bmi-1shRNA对LoVo细胞bmi-1mRNA表达抑制率为80%、bmi-1蛋白抑制率为82%,P<0.05。结论针对bmi-1基因的shRNA表达载体能够明显抑制结肠癌细胞LoVo的增殖能力,bmi-1mRNA与蛋白表达受抑制,但对细胞形态学无明显影响。

摘要：目的:构建针对原癌基因bmi-1的shRNA逆转录病毒表达载体,检测它对大肠癌细胞株SW480增殖的影响。方法:利用载体介导的RNA干扰技术,设计、合成靶向bmi-1基因、编码短发夹RNA的寡核苷酸序列,并设计无义对照序列,构建重组载体pSIREN-bmi-1及pSIREN-bmi-1-c,载体经脂质体2000介导转染SW480细胞,经MTT检测,观察bmi-1表达受抑后对细胞增殖的影响。结果:成功构建了针对bmi-1基因的shRNA表达载体。结论:针对bmi-1基因的shRNA表达载体能够明显抑制结肠癌细胞SW480的增殖能力。

摘要：观察bmi-1基因沉默对A549细胞体外迁移和体内转移的影响。设计针对bmi-1的小干扰RNA(siRNA)序列作为靶序列构建重组逆转录病毒siRNA表达载体并将其转染入肺腺癌A549细胞;应用RT-PCR和Western Blot方法检测对bmi-1基因的沉默效果;应用划痕修复和Transwell方法检测bmi-1-siRNA对A549细胞体外迁移的影响;通过裸鼠尾输入各组细胞,观察bmi-1-siRNA对A549细胞在裸鼠体内转移能力的影响。结果显示:沉默bmi-1基因的表达能够抑制A549细胞的体内外迁移能力,同时降低VEGF的分泌。bmi-1-siRNA能抑制肺腺癌A549细胞的转移能力,VEGF可能参与其中。