摘要：bt毒素是苏云金芽孢杆菌产生的一类生物大分子蛋白质,对多种常见的农林害虫甚至卫生媒介蚊虫都有特异性毒杀活性,是具备重大经济价值和生态环境效益的绿色抗虫材料。然而,随着bt毒素制剂和转基因抗虫作物长期应用,致使靶标害虫抗药性进化加快,并对非靶标生物的交互毒性等潜在风险加大,因此对其残留监测成了农业食品和环境安全风险评估的重要内容。本研究梳理了bt毒素传统的依托微生物表达体系的制剂和植物表达体系的转基因抗虫作物应用及其对靶标害虫抗药性和非靶标生物交互毒性潜在风险的研究现状,概述了针对bt毒素残留分析的免疫检测研究进展;并结合本研究团队近年来依托热门的噬菌体展示抗体库技术,在bt毒素特异性基因工程抗体创制以及bt毒素抗虫模拟物靶向设计等方面的最新研究成果,探讨了基于bt毒素的新型安全杀虫蛋白质创新研发与应用策略及其毒素蛋白质残留检测技术创新等未来潜在发展动向和可行捷径,为进一步围绕bt毒素的相关研究提供有价值的文献资料和新的思路。

摘要：抗独特型抗体制备技术是开发新型抗虫蛋白资源的一项创新策略。为设计构造以基因工程抗体为基础的杀虫蛋白资源,制备了对小菜蛾(Plutella xylostella)具有杀虫活性的猪、牛源改型单链抗体(single chain variable fragment,sc Fv)。通过NCBI数据库搜索猪、牛源抗体重、轻链可变区的8个骨架区,在其中植入人源抗独特型sc Fv 3E1的6个互补决定区,并进行人工合成及替换成噬菌体展示表达载体p IT2;利用间接竞争ELISA对动物源化改型sc Fv进行分型鉴定;利用表面等离子共振(surface plasmon resonance,SPR)技术分析动物源化改型sc Fv与小菜蛾刷状缘膜囊泡(brush border membrane vesicles,BBMV)的结合能力;采用浸叶法测定动物源化改型sc Fv对小菜蛾的生物活性。通过替换表达载体获得了猪源swine-3E1-p IT2质粒和牛源bovine-3E1-p IT2质粒,结果显示:swine-p IT2和bovine-p IT2表达上清液对Cry1B与其多克隆抗体(p Ab)结合的抑制率分别为44.3%和43.0%,模拟抗原Cry1B的某些结构功能,发现两者均属于β型抗独特型sc Fv。SPR分析发现,swine-p IT2、bovine-p IT2与小菜蛾BBMV的结合能力分别为209.48和195.31 RU。生物活性测定结果显示,改造后的swinep IT2和bovine-p IT2对小菜蛾幼虫均具有杀虫活性,LD_(50)值分别为5.90×10^(7)和6.22×10^(7)CFU/m L,均低于亲本3E1的6.86×10^(7)CFU/m L;并且改造后2种材料的毒力回归方程的斜率分别为1.50和1.48,均高于3E1(1.23)。综上,动物源化swine-p IT2和bovine-p IT2改型sc Fv属β型抗独特型sc Fv,能够与小菜蛾的BBMV结合,且具有杀虫活性,为新型生物农药蛋白资源挖掘提供了新的思路。

摘要：害虫是威胁农作物生长发育及产品品质的主要风险因素,对其有效防治是保障农作物稳定生产的重要环节。传统依赖化学农药对害虫防治效果显著,但化学农药本身对非靶标生物以及生态环境所造成的持久性危害风险也同样突出。害虫绿色防治是农业可持续发展的必然要求,其中具杀虫功能的蛋白类生物材料因兼具安全性高、可量产药剂及可在转基因抗虫作物应用的多重优势,是害虫绿色防治创新研发和应用的热点。如具备杀虫功能的bt毒素、凝集素、动物毒素、防御素、蛋白酶抑制剂等蛋白类生物材料在害虫防治上已有深入研究和广泛应用;此外,近年来包括杀虫抗体在内的一些新型杀虫蛋白和相应创新技术也不断涌现,发展极为迅猛。基于此,本文在系统梳理当前成熟的具杀虫功能的蛋白类生物材料研发和应用现状的基础上,结合作者团队在杀虫抗体靶向设计上取得的原创性研究成果和经验,对蛋白类生物杀虫材料潜在的创新研发与应用进行展望,旨在为农业害虫绿色防治研究提供最新文献资料和技术参考。

摘要：构建可用于特异性单链抗体(ScFv)筛选和应用的大容量鼠源噬菌体抗体展示库,获得拥有自主知识产权的抗体库材料。从小鼠脾脏细胞中提取总RNA,反转录成c DNA后,分别扩增抗体的重链基因、轻链基因,并设计2条互补的Linker基因。采用重叠延伸PCR(SOE-PCR)法将重链-Linker和Linker-轻链拼接为完整的ScFv基因,酶切、酶连后,将ScFv基因克隆到pCANTAB-5E噬菌粒载体上,经电穿孔导入*** TG1感受态细胞中,过夜培养获得初级噬菌体展示库。以单克隆菌落数计算库容量大小,通过比对随机挑取的单克隆噬菌体ScFv可变区序列的差异,分析库的多样性。以bt毒素(Cry1B、Cry1C、Cry1F)为包被抗原,从库中筛选具有结合活性的ScFv验证库的实用性。经检测,提取的总RNA条带清晰,浓度为2.76μg/μl,扩增的抗体重链基因、轻链基因条带清晰,且2条互补的Linker基因成功添加到重链基因和轻链基因上。经SOE-PCR法扩增,重链-Linker与Linker-轻链成功拼接为ScFv基因。电转化后,经PCR(Polymerase chain reaction)扩增和凝胶电泳检测,证实ScFv基因克隆成功,测得初级噬菌体抗体展示库的库容为3.67×10~8。随机挑取12个单克隆菌种进行测序和比对,证实ScFv基因为鼠源抗体基因,且12个单克隆菌种的ScFv基因可变区均有一定差异,说明ScFv基因具有多样性。以3种bt毒素(Cry1B、Cry1C、Cry1F)为抗原,经4轮特异性富集筛选后均获得了具有抗原结合活性的噬菌体ScFv菌种,表明该库的实用性较强。