摘要：将猪肌生成抑制素编码序列下游 883～ 1 1 2 6 bp按大肠杆菌嗜好密码子进行优化 ,将优化后序列双链分成 1 2个单链片段 (F1 、F2 、F3、R6 、R5、R4 、F4 、F5、F6 、R3、R2 、R1 ) ,采用化学合成方法合成 ,每对相邻互补片段之间有 2 0 bp序列交叉重叠。F1 长 38bp,R1 长 36 bp,其他片段均 4 0 bp长 ,F1 和 R1 片段两端分别加上限制性内切酶 Nco 和 Xho 的识别位点序列。经 PcR扩增出 2 5 4 bp片段 ,该片段与 p MD1 8- T载体连接 ,转化 JM1 0 9感受态细胞 ,所得阳性克隆进行测序分析 ,得到的克隆序列与设计的序列完全一致 ,表明成功地获得了猪肌生成抑制素下游编码序列克隆载体。从阳性细菌中提取质粒 ,经 Nco 和 Xho 酶切 ,回收 2 5 4 bp目的片段 ,定向克隆到 p ET2 8a中 ,转化 DH5α受体菌 ,提取质粒 ,再转化到 BL2 1 (DE3)中 ,成功筛选出阳性克隆。阳性菌经 IPTG诱导 ,通过 SDS- PAGE。

摘要：本研究旨在获得产气荚膜梭菌α毒素(cPA)c末端(第247-370位氨基酸,cPA_c)三拷贝串联融合蛋白,并评价其免疫原性。对已知的A型产气荚膜梭菌cPAc编码基因(GenBank登录号:AY823400.1)进行优化设计,以同向串连的方式串联成三拷贝基因(GcPA_(c3)),片段之间用柔性氨基酸linker(GGGS)连接,经人工合成后克隆至原核表达载体pET-30a(+)中进行表达与纯化,获得cPA_c的三拷贝重组蛋白(rcPA_(c3))。利用Western blotting方法检测rcPA_(c3)与A型产气荚膜梭菌毒素抗血清的反应性。将rcPA_(c3)与Montanide ISA 201佐剂混合乳化制备疫苗,免疫4只健康家兔,检测一免及二免后兔血清的中和抗体效价。在二免21d后,对家兔经耳缘静脉注射1个家兔最低致死剂量(MLD)的A型产气荚膜梭菌毒素,检测rcPA_(c3)对家兔的免疫保护效果。结果显示,rcPA_(c3)主要以包涵体的形式表达,且能与A型产气荚膜梭菌毒素抗血清反应;每毫升的一免抗血清可中和30～50个、二免抗血清可中和70～100个小鼠MLD的A型产气荚膜梭菌毒素。采用1个家兔MLD的A型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组家兔100%(4/4)死亡,免疫组得到了100%(4/4)的保护。以上结果说明,rcPA_(c3)具有良好的免疫原性,为A型产气荚膜梭菌病基因工程疫苗的研制提供了重要的试验数据。

摘要：本研究旨在获得产气荚膜梭菌α毒素(cPA)c末端(第247-370位氨基酸,cPA_c)二拷贝串联融合蛋白,并评价其免疫原性。对已知的A型产气荚膜梭菌cPA_c编码基因进行优化设计,将其以同向串连的方式串联成二拷贝基因(GcPA_(c2)),经人工合成获得基因片段GcPA_(c2)。将GcPA_(c2)克隆至原核表达载体pET-30a (+)中进行表达与纯化,获得重组蛋白rcPA_(c2)。利用Western Blot方法检测rcPA_(c2)与A型产气荚膜梭菌毒素抗血清的反应性。随后,用rcPA_(c2)免疫家兔,并检测一免及二免后兔血清的中和抗体效价。在二免21 d后,经耳缘静脉注射1个家兔MLD的A型产气荚膜梭菌毒素,检测rcPA_(c2)对家兔的免疫保护效果。结果表明,rcPA_(c2)主要以包涵体的形式表达且能与A型产气荚膜梭菌毒素抗血清反应。每毫升的一免和二免抗血清分别可中和30个和80个小鼠MLD的A型产气荚膜梭菌毒素。1个兔MLD的A型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组4/4死亡,免疫组得到了100%(4/4)的保护。以上结果说明,rcPA_(c2)具有良好的免疫原性,从而为A型产气荚膜梭菌病基因工程疫苗的研制提供了重要的实验数据。

摘要：为获得产气荚膜梭菌α毒素(cPA)的c末端(cPAc)与中和抗原表位NE(ARGFAK)的串联融合蛋白并评价其免疫原性,对已知的A型产气荚膜梭菌cPAc及NE的编码基因进行优化设计,并将两个基因的三拷贝序列串联,经人工合成获得基因片段GcPAc3NE3。将该片段克隆至原核表达载体p ET30a(+)中进行表达与纯化,获得重组蛋白。利用Western blot方法检测重组蛋白与A型产气荚膜梭菌毒素抗血清的反应性。随后,以纯化的重组蛋白免疫家兔,根据《中华人民共和国兽药典》(2015年版)规定的方法检测家兔血清的中和抗体效价。在二免后21 d,以1个MLD的A型产气荚膜梭菌毒素对家兔进行攻毒。结果表明重组蛋白主要以包涵体的形式存在表达且能与A型产气荚膜梭菌毒素抗血清反应。每毫升的一免抗血清可中和40个最小致死量(MLD)、二免抗血清可中和80个MLD的A型产气荚膜梭菌毒素;1个MLD的A型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组4/4死亡,免疫组得到了100%(4/4)的保护。以上结果说明,重组蛋白具有良好的免疫原性,从而为A型产气荚膜梭菌病基因工程疫苗的研制提供了重要的实验数据。