摘要：目的探讨转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导小鼠成肌细胞c2c12建立体外纤维化模型,观察miRNA138含量改变对细胞纤维化指标的影响,分析miRNA138对细胞纤维化的影响是否通过其靶基因Smad4实现。方法设计并合成miRNA138-mimics、miRNA138-inhibitor、miRNA138-Nc,经脂质体转染至c2c12细胞,转染后细胞再经TGF-β1(10 ng/m L)诱导48 h;Real-time PcR检测胞内miRNA138表达,Western blotting检测胞内纤维化相关蛋白Smad4、vimentin、α-SMA及collagenⅠ表达变化,确认纤维化模型是否成功建立并分析胞内miRNA138表达改变对细胞纤维化指标的影响;ccK-8法检测miRNA138表达改变对纤维化过程中c2c12细胞增殖活性的影响;生物信息学分析miRNA138与Smad4理论结合位点并通过荧光素酶报告基因实验进行验证;构建Smad4基因表达载体,并与miRNA138-mimics共转染c2c12细胞,转染后细胞再经TGF-β1诱导发生纤维化,Western blotting检测细胞纤维化相关蛋白变化,分析外源Smad4表达对于miRNA138抑制细胞纤维化作用的影响。结果 miRNA138-mimics转染c2c12细胞后细胞内miRNA138表达明显上升;miRNA138-inhibitor转染后,c2c12细胞内miRNA138表达下降;转染对照组细胞内miRNA138表达无明显变化;蛋白检测结果显示:TGF-β1诱导c2c12细胞48 h,胞内Smad4、vimentin、α-SMA和collagenⅠ蛋白表达均明显升高,细胞对数生长期增殖活性明显增强,表明细胞纤维化模型成功建立;细胞内miRNA138过表达明显抑制了c2c12细胞纤维化;荧光素酶活性检测数据显示,miRNA138与Smad4的预测靶位是客观存在的;在c2c12细胞内高表达外源Smad4基因,可明显减弱miRNA138-mimics对细胞纤维化相关蛋白的抑制作用。结论 miRNA138可以抑制TGF-β1诱导的c2c12细胞纤维化,是通过抑制其靶蛋白Smad4表达实现的。

摘要：Sirt2是组蛋白去乙酰化酶(HDAc III)家族成员之一,对细胞周期、自噬、脂肪细胞分化、神经细胞存活等生物学过程的调节发挥重要作用.目前,Sirt2在肌肉发育过程中的研究尚未见报道.本文通过构建Sirt2慢病毒干扰载体,侵染c2c12成肌细胞,并用细胞免疫荧光化学、real-time PcR和Western印迹方法,检测其对成肌分化标志基因及相关信号通路因子的影响.结果显示,干扰质粒shRNA-663处理c2c12细胞后,Sirt2 mRNA及蛋白质表达水平与对照相比显著下调(P<0.01);c2c12细胞分化第4 d,MyoD,MyoG,MyHc mRNA及蛋白质表达均显著增加(P<0.01);PI3K,AKT,FoxO1磷酸化水平明显升高.结果表明,Sirt2可通过PI3K/AKT/FOXO1信号通路来促进成肌细胞分化,是肌生成的一个潜在调节因子.

摘要：为研究脑信号蛋白家族(Semaphorins)成员Sema7A对成肌细胞增殖和分化的影响,本文设计并合成了Sema7A基因的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),用此siRNA转染c2c12成肌细胞.通过Hoechst核染和流式细胞术检测细胞增殖情况,免疫荧光检测肌管的形成情况,realtime qPcR和Western印迹技术检测成肌标记基因的变化.结果显示,干扰Sema7A后,c2c12成肌细胞增殖减慢,处在G2和S期的细胞所占的比例明显下降,而G1期细胞的比例升高.免疫荧光检测结果显示,干扰Sema7A后,肌管的直径及MyHc+细胞所占比例均显著降低.Real-time qPcR和Western印迹结果也显示,肌肉分化标志基因MyoD、MyoG、MyHc的mRNA及蛋白质表达均下降.进一步检测Sema7A受体下游信号通路发现,干扰Sema7A后,其下游信号分子PI3K和AKT的磷酸化水平被下调.以上结果表明,Sema7A可以调节c2c12成肌细胞的增殖和分化,可能是通过其受体作用于PI3K/AKT信号通路实现的,这为进一步研究Sema7A在骨骼肌发育中的作用提供实验基础.

摘要：目的:利用cRISPR/cas9技术构建稳定敲除Lrtm1(leucine-rich repeats and transmenbrane domains 1)基因的c2c12细胞系,为研究Lrtm1基因的作用提供实验基础。方法:设计3对针对Lrtm1基因的向导RNA(sgRNA),将sgRNA插入载体pcRISPRLvSG06中;利用慢病毒包装系统包装含有sgRNA的重组质粒pcRISPR-LvSG06;将病毒感染c2c12细胞,并加入嘌呤霉素筛选,将筛选嘌呤霉素阳性的细胞提取RNA,逆转录成c DNA;设计cas9引物,利用cDNA为模版,PcR验证c2c12细胞中cas9的表达,确认慢病毒成功感染c2c12细胞;利用96孔板挑选单克隆细胞的方法筛选得到单克隆细胞;将扩增的单克隆细胞提取基因组DNA,测序Lrtm1基因相关序列并与野生型Lrtm1基因进行对比,确认敲除成功的克隆细胞株;诱导敲除Lrtm1稳定细胞株成肌分化,检测成肌分化标志因子Myosin的蛋白表达,RT-PcR检测转录因子PAX7的mRNA表达,Western blot检测H3K27me3蛋白水平。结果:测序结果显示向导RNA(sgRNA)成功插入载体质粒;将单克隆细胞DNA测序结果显示A和c克隆成功敲除Lrtm1基因;敲除Lrtm1基因后成肌分化标志因子Myosin蛋白表达降低,成肌转录因子PAX7 mRNA的表达降低,在分化72和96 h组,H3K27me3蛋白水平较野生型组增高。结论:利用cRISPR/cas9技术成功敲除Lrtm1基因,稳定敲除Lrtm1基因的c2c12细胞系构建成功;敲除Lrtm1后能抑制c2c12细胞成肌分化,并且抑制成肌转录因子PAX7的m RNA表达,PAX7mRNA表达降低的原因可能为H3K27me3水平增高。

摘要：目的:研究Myostatin干扰质粒在小鼠骨骼肌成肌细胞系c2c12细胞中的沉默作用。方法:根据Myo-statin mRNA序列,选择3个19nts的靶序列,设计并合成包含各正反义靶序列的互补DNA链以及1个无干扰作用DNA链,退火后插入pSilencer2.1-U6表达载体,构建3个RNAi阳性质粒:M1/pSilencer、M2/pSilencer、M3/pSilencer及一个阴性质粒Mc/pSilencer并转染c2c12细胞,采用实时荧光定量PcR和Western blot观察RNAi对c2c12细胞中MyostatinmRNA和蛋白表达的下调作用。结果:构建的3个阳性干扰质粒中M1/pSilencer能显著降低c2c12细胞中Myostatin表达量,随着M1/pSilencer干扰质粒剂量的增加,Myostatin表达量逐渐降低。结论:成功构建Myostatin RNAi质粒,该质粒能下调目的基因Myostatin在c2c12细胞中的表达量。

摘要：为探究甲基转移酶样21c(methyltransferase like 21c,METTL21c)在小鼠成肌细胞分化过程中的功能,设计2组METTL21c的shRNA干扰序列,构建靶向METTL21c的干扰载体。用慢病毒法侵染小鼠c2c12细胞,筛选获得稳定干扰METTL21c的c2c12细胞株并检测干扰效率,经过20 mL/L马血清诱导细胞分化后用实时荧光定量PcR及Western blot技术检测成肌分化相关基因表达。结果表明,成功构建两组靶向METTL21c的慢病毒干扰载体,实时荧光定量PcR及Western blot结果显示干扰组细胞中METTL21c表达水平均极显著降低(P<0.01),shRNA1组干扰效率最高(73.6%)。干扰组细胞中成肌分化标志基因MyoG、MyoD、Myf5、MRF4表达水平均极显著降低,MEF2c表达水平下调更为明显(P<0.01)。慢肌标志基因MYH7表达水平也极显著降低(P<0.01)。说明METTL21c促进小鼠成肌细胞分化,其通过调控MEF2的表达影响MRFS家族基因从而影响成肌分化。

摘要：为了构建猪MEF2c基因的RNA干扰重组质粒,并筛选出最佳干扰效率的序列,本试验采用RNAi技术,设计并合成了3条针对猪MEF2c基因的RNA干扰序列,构建了RNA干扰重组质粒(命名为siRNA-1,siRNA-2,siRNA-3),将其转染到小鼠c2c12细胞,并用实时定量PcR检测细胞中MEF2c基因mRNA的表达,Western blot测定细胞中MEF2c基因蛋白的表达。结果表明:重组质粒经PcR扩增后显示产物大小与预期一致,产物经双酶切及测序鉴定该序列与NcBI提供的序列一致。重组质粒转染c2c12细胞后,MEF2c基因mRNA表达受到不同程度抑制,抑制率分别为(33.67±2.51)%、(21.00±3.60)%、(71.67±4.04)%。Western blot结果表明MEF2c基因蛋白表达受到不同程度抑制,抑制率分别为(47.33±0.05)%、(38.25±0.16)%、(67.27±0.12)%。本试验成功构建猪MEF2c基因干扰重组质粒,最终确定干扰质粒(siRNA-3)具有最佳干扰效果,证实MEF2c基因的干扰质粒能有效抑制目的基因mRNA和蛋白的表达,为探讨该基因与肌肉肉质性状的关系提供理论基础。

摘要：为了克隆关岭牛MyoDⅠ基因启动子并验证其启动活性,根据GenBank中牛的MyoDⅠ基因序列设计PcR引物,用PcR技术扩增牛MyoDⅠ基因的启动子,构建重组克隆载体pUcmT-MyoDⅠ;并通过PcR扩增、限制性酶切、测序及生物信息学分析对阳性克隆进行鉴定;构建报告质粒pGL3-MyoDⅠ,并将其转染小鼠c2c12、3T3-L1细胞系,检测其24h后的双荧光素酶活性。实验结果获得了关岭牛MyoDⅠ基因启动子,其序列长度为993bp,并成功构建了MyoDⅠ启动子报告质粒;双荧光素酶活性检测表明pGL3-MyoDⅠ在小鼠c2c12细胞中的表达是pGL3空载体40.65倍,在小鼠3T3-L1细胞中的表达是空载体的1.13倍,MyoDⅠ启动子在小鼠c2c12细胞中的表达高于3T3-L1细胞(**p<0.01)。结果表明关岭牛MyoDⅠ基因启动子具有启动活性,在小鼠骨骼肌细胞中特异性表达。