摘要：构建靶向大鼠c5aR基因的短发夹RNA(shRNA)表达载体,验证c5aR蛋白的功能,为后续进一步研究c5aR在免疫治疗中的作用奠定基础。具体方法是根据基因库提供的大鼠c5aR mRNA核苷酸序列(序列号:NM_053619),设计并合成短发夹结构的互补DNA序列,克隆到经BamHI和EcoR I双酶切的线性化质粒pLVX-shRNA,构建重组质粒,并予以DNA测序鉴定。重组干扰质粒构建成功后,通过脂质体2000转染大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E,LPS处理后收集细胞,采用荧光定量RT-PcR(RT-qPcR)和Western blotting法检测干扰质粒对c5aR基因的表达抑制效应。通过尾静脉高压注射技术将重组干扰质粒导入Wistar大鼠肾脏,采用腹腔注射LPS方法复制脓毒血症急性肾损伤模型,大鼠随机分为正常对照组、LPS处理组、LPS+c5aR shRNA转染组,采用ELISA方法检测血清中cr、BUN以及TNF-α、IL-6等炎性因子的含量。结果显示构建的shRNA序列经DNA测序证实与设计序列完全一致,重组质粒构建成功。转染c5aR shRNA后,NRK-52E细胞中c5aR mRNA和c5aR蛋白表达水平显著下降(P<0.05)。该重组干扰质粒能有效抑制c5aR基因的表达,能显著抑制由LPS诱导的TNF-α、IL-6等炎性因子的释放,改善大鼠肾脏功能,对LPS诱导的肾脓毒血症损伤具有明显保护作用。

摘要：目的 :从蛋白质结构与功能的关系出发 ,探讨c5aR与其配体的c5a的结合位。方法 :按分子设计理论 ,采用亲水性方案寻找c5aR胞外区高亲水性区域 ,Fmoc方案人工合成c5aR第 9～ 30位氨基酸基序 (P2 2肽 ) ,经高效液相色谱纯化 ,毛细管电泳鉴定。结果 :合成多肽 (P2 2 )的纯度为 95 19% ,每次缩合的平均效率为 99 78% ;能与anti c5aRMcAb(S5 1,Serotic公司 )有效地结合 ,酶联OD490极显著高于同浓度对照多肽c2 0 ;还可被配体rh c5a( 10ng ml)明显抑制而降低其酶联OD值 (P <0 0 5 ) ,此外 10ng mlP2 2还可抑制rhc5a所致U937细胞胞浆ca2 + 升高 (P <0 0 1)。结论 :从c5aR分子中寻找c5a结合位基序 ,可拮抗c5a的过敏毒素作用 。