摘要：近年来随着科学技术的飞速发展,嵌合抗原受体t细胞(chimeric antigen receptor-t cell,car-t)产品从分子设计到制备技术均取得了突破性进展,疾病治疗范围从血液系统肿瘤逐步扩大至自身免疫性疾病及实体瘤。然而,生产成本高、产能低是目前car-t产品面临的最大现实问题,严重限制了其临床可及性。原辅料价格高昂、定制化生产导致的质检费用和公用设施设备投入无法摊薄、技术依赖下的高人力成本均是car-t产品成本居高不下的重要原因。对目前造成car-t产品高成本的具体因素及针对性解决方案进行分析,总结发展趋势,以期为car-t制备技术的降本增效提供一些参考和建议。基因转导工艺改良,特别是非病毒转导系统的开发、通用型细胞治疗产品的探究、国产自动化设备的布局,是未来car-t技术发展的重要方向。随着科研人员的持续攻坚,car-t产品成本下降将成为必然趋势,最终成为普通患者可及的“平民化”治疗药物,为重病患者提供更多治疗机会。

摘要：近年来细胞治疗技术飞速发展,其中,嵌合抗原受体t细胞免疫疗法(Chimeric Antigen Receptor t Cell Immunotherapy,car-t)治疗恶性肿瘤潜力巨大。但细胞制备工艺十分复杂、制造成本高昂,且手动生产工艺因开放性会导致潜在污染风险和批次质量差异,急需开发全封闭、自动化的car-t细胞生产设备。根据car-t细胞制备工艺流程,开发了一套符合药品生产质量管理规范(Good Manufacturing Practice of Medical Products,GMP)的全封闭、自动化的car-t细胞制备与监控系统。该系统由管路模块(反应器、一次性管路、试剂袋)、机电控制模块(夹管阀、蠕动泵、电机、磁铁转位机构)和培养环境核心参数(温度、pH、CO_(2)浓度、溶解氧(Dissolved Oxygen,DO)浓度)监控模块,以及辅助系统模块构成;细胞制备过程可溯源。实验证明该系统具备t细胞分离、免疫磁珠分选、物料自动定量添加、培养环境在线监控、细胞收集等功能。

摘要：car-t细胞疗法是近十年来免疫医学的重大突破,大量的car-t细胞疗法的项目纷纷选择在国内落地。快速建立car-t细胞治疗生产线室,需要考虑项目落地的生产厂房的选择。设计生产厂房时,需综合考虑消防排烟管道、消防喷淋管、电缆桥架及工艺管道、空调风管等管道布置,生产厂房的层高选择尤为重要。从减少空调系统阻力、节约能耗、利于系统的调试、维护运行、利于室内工艺平面的布局等方面来分析合适的层高对选择car-t生产厂房的重要性。通过对各种管道布置的优化设置,各方面因素同时综合考虑,car-t生产线选择层高≥6.5 m的丙类工业厂房为最佳。

摘要：细胞治疗领域因其高度精准化和个性化的优势,已成为未来人类医学发展的热门方向。细胞治疗是指应用人的自体、同种异体或异种(非人体)的细胞,经体外操作后回输(或植入)人体的治疗方法。其中嵌合抗原受体t细胞免疫疗法(car-t细胞疗法)是近几年兴起的过继性细胞免疫治疗,主要通过将嵌合抗原受体的特异性与t细胞的免疫作用相结合,再经过特异性识别对恶性肿瘤细胞进行杀伤。car-t细胞疗法的传统领域主要是治疗血液恶性肿瘤,临床效果较好。目前,全球上市的car-t细胞疗法产品共计7种。本研究梳理了car-t细胞疗法的结构组成和发展历程,概述了全球上市的car-t细胞疗法在血液肿瘤方面应用的前沿进展,探讨了car-t细胞疗法当前面临的两大问题(毒副作用问题和复发率问题);同时聚焦这些问题挑战分别给出了解决策略:通过改进car-t细胞结构降低细胞毒性、通过调整给药策略降低剂量、通过常规药物治疗减小毒副作用和通过设计多靶向抗原car-t细胞降低复发率;最后提出展望:通过设计开发有效、安全和低成本的car-t细胞疗法,同时采用联合治疗和疾病监测方法,将car-t细胞疗法的全部治疗潜力发挥出来,旨在为我国细胞疗法领域的专家学者提供参考。

摘要：目的研究在甲基丙烯酰化明胶中培养的car-t细胞功能及活性的变化,以及用GelMA为载体,负载缓释car-t细胞的可行性。方法基因编辑靶向表皮生长因子受体(EGFR)的第二代car-t细胞,制备负载car-t的甲基丙烯酸酯明胶,通过水凝胶成胶过程图像、储存及损耗模量验证水凝胶成功制备;使用荧光显微镜荧光成像、流式细胞分析验证car-t的成功转染;应用CCK-8实验检测水凝胶的生物相容性;构建共培养模型,利用Elisa试剂盒、细胞毒性LDH试剂盒检测上清液中释放的细胞因子、LDH,检测car-t是否成功活化,评估car-t细胞杀伤效应。结果荧光显微镜下观察转染第4天的car-t细胞,见car-t细胞聚集成团并散发绿色荧光;第9天流式细胞术示CD3+t细胞的慢病毒转染率为42.2%,CD8+t细胞:CD4+t细胞约为1∶1,car-t细胞成功制备。CCK8实验示水凝胶无毒性。Elisa试剂盒示上清液中细胞活性因子IFN-γ释放量显著增多,提示car-t细胞识别EGFR抗体后,可成功活化。当效靶比为1∶1时,U87细胞毒性为71.75%,而U87 EGFRvⅢ细胞毒性为18.13%。结论甲基丙烯酸酯化明胶负载培养的car-t细胞活性良好,功能正常,可设计使用该水凝胶负载递送car-t细胞,实现car-t细胞的精确靶向治疗。

摘要：目的评估以甲胎蛋白(AFP)-MHC复合物为靶向的car t细胞治疗肝癌的效果。方法使用EasySep人类t细胞分离试剂盒分离t细胞。双特异性抗体Et1402L1设计成包含CD28/CD3共刺激域的第二代car,将car构建体克隆到慢病毒载体中,转导原代人t细胞。通过HepG2细胞构建小鼠异种肝癌肿瘤模型。将细胞分为HepG2组和AFP-car t细胞组,小鼠分为肿瘤模型组20只和AFP-car t靶向治疗组20只。通过CCK-8试剂盒检测细胞增殖。通过细胞LDH释放测定法测量t细胞毒性。PCR检测细胞因子tNFα、IFNγ、IL2和IL10的mRNA表达。ELISA分析肿瘤小鼠AFP水平。采用碘海醇对小鼠脏器组织造影成像。结果第1天两组细胞增殖比较没有差异(P>0.05),第3、5和7天,AFP-car t细胞组细胞增殖较HepG2组降低(P0.05),第10、20、30、40天,AFP-car t靶向治疗组肿瘤大小较肿瘤模型组减小(P<0.05)。肿瘤模型组AFP水平为(2564.18±265.19)μg/mL,AFP-car t靶向治疗组为(837.49±63.22)μg/mL(P<0.05)。结论以AFP-MHC复合物为靶向的car-t细胞靶向细胞内分泌的肿瘤抗原产物是可行有效的。

摘要：目的探讨靶向Ⅰ型受体酪氨酸激酶样孤儿受体(ROR1)的嵌合抗原受体修饰的t细胞(chimeric antigen receptor t cell, car-t)治疗ROR1阳性肿瘤细胞的体外杀伤作用。方法设计并合成car基因,通过慢病毒载体质粒pWPXLd,构建靶向ROR1的car-t核心质粒,采用BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切鉴定,应用流式细胞术检测多种实体瘤癌细胞株表面ROR1的表达,并采用流式细胞术、乳酸脱氢酶(LDH)检测试验检测car-t对ROR1阳性肿瘤细胞的杀伤作用,ELISA检测试剂盒测定培养细胞上清中γ-干扰素(IFN-γ)含量。结果构建的car-t质粒双酶切鉴定有car基因插入,流式细胞术检测结果显示car-t感染效率约为47.23%。多种肿瘤细胞不同程度表达ROR1。流式细胞术、LDH检测试验结果提示car-t能特异性地杀伤ROR1阳性肿瘤细胞。car-t针对ROR1阳性靶细胞能释放更多的IFN-γ(P<0.05)。结论成功构建靶向ROR1的car-t,并能特异地杀伤ROR1阳性肿瘤细胞,释放大量IFN-γ,为临床应用提供了实验基础。

摘要：该文针对肿瘤微环境中的缺氧环境,利用缺氧相关的启动子,设计和制备在缺氧环境中诱导表达靶向前列腺干细胞抗原(PSCA)的嵌合抗原受体修饰的t细胞(car-t),研究缺氧条件下其嵌合抗原受体(car)的表达及对肿瘤细胞的体外杀伤作用。研究者通过基因合成缺氧启动子(5H1P)和car的DNA片段,利用酶切方法将其插入到慢病毒载体中,然后感染t淋巴细胞。在体外用CoCl2构建缺氧模型,通过流式细胞术检测CoCl2未诱导组car有42%的弱阳性表达,诱导后阳性率增加到84.4%,且荧光强度显著增加。结果表明,诱导组比不诱导对照组抗肿瘤效果更好。综上所述,该实验成功构建了靶向PSCA的缺氧诱导型car-t,使其在缺氧的环境中效能增强,这为car-t在实体瘤的治疗方面提供了新的方案。

摘要：嵌合抗原受体t细胞(chimeric antigen receptor t-cell,car-t)在血液肿瘤中显示出惊人的疗效,是近年来肿瘤研究最重要的突破之一。car-t疗法兼具细胞治疗、基因治疗和免疫治疗,是生物工程设计的经典案例。本文回顾了car-t的发展历史,解析其中设计的演化逻辑,并梳理car-t面临的挑战以及car-t设计相应的调整升级。本文将帮助人们深入理解car-t治疗癌症的原理,并对car-t所面临的挑战和未来的发展方向有更深刻的认识。

摘要：目的 car-CD19-CIK和car-CD19-t效应细胞在体外对表达CD19的K562稳定细胞株杀伤能力和杀伤特异性的比较。方法效应细胞的构建是以通过基因合成和分子克隆手段构建car-CD19片段,以酶切的方法将car-CD19片段插入到慢病毒载体上;分离获得同一个健康志愿者外周血单核细胞,一部分加IFN-γ、重组人IL-1α、CD3单克隆抗体、重组人IL-2等细胞因子诱导CIK细胞产生;另一部分体外分选CD3阳性t细胞,car-19慢病毒同时感染CIK细胞和t细胞,采用流式细胞术检测转导效率和细胞分型;CD19+的靶细胞是由装载CD19基因表达的慢病毒载体转导K562细胞系,通过抗菌素的压力选择而构建;乳酸脱氢酶释放法(LDH)检测car-CIK细胞和car-t细胞对靶细胞的杀伤效率,炎性因子检测(CBA)法检测由car-CIK细胞和car-t细胞的细胞因子的分泌水平。结果同一CD19-car慢病毒载体在相同转导条件下,对原代CIK细胞的转导效率是60.5%,对原代t细胞的转导效率是36.2%;当效靶比5:1、10:1和20:1在这三种比例时,car-19-CIK细胞对CD19-K562细胞的杀伤效率分别为14.65%、33.08%和42.5%,对K562细胞的杀伤效率分别为8.3%、10.1%和24.9%;而car-19-t细胞对CD19-K562细胞的杀伤效率分别为17.22%、26.52%和32.49%,对k562细胞的杀伤效率分别为0.1%、3.6%和10.3%。结论 car-19-CIK细胞的杀伤作用明显强于CIK细胞;car-19-t细胞杀伤特异性比car-19-CIK细胞强。本研究对car-t和car-CIK免疫细胞治疗血液肿瘤的新策略和新临床方案设计提供了有意义的实验数据。