摘要：构建并鉴定人carabin蛋白过表达慢病毒载体,筛选carabin过表达的弥散性大B淋巴瘤细胞SUDHL-6的稳定细胞株。通过设计carabin上下游引物,用同源重组的方法构建慢病毒载体pLENTI-c GFP-carabin,将其与psPAX2和pMD2.G包装质粒按3∶2∶1的比例用PEI Transfection Reagent共转染HEK293T细胞制备病毒,用病毒颗粒感染SU-DHL-6细胞2周后,用流式细胞仪分选GFP表达阳性的细胞,Western Blot检测carabin-GFP融合蛋白表达。成功构建pLENTI-c GFP-carabin慢病毒过表达载体。包装病毒颗粒并感染SU-DHL-6细胞后,荧光显微镜检测和流式细胞分选鉴定表达效率为26.5%,筛选出的GFP阳性细胞用Western Blot检测到carabinGFP融合蛋白表达。成功构建了carabin过表达慢病毒载体并筛选出了carabin-GFP稳定表达的细胞株。

摘要：目的:构建高滴度大鼠carabin腺病毒干扰载体(Ad-carabin-shRNA)。方法:设计3对carabin-shRNA寡核苷酸序列,分别构建3个ADV4-U6-CMV-carabin-shRNA腺病毒穿梭质粒,将构建好的ADV4-U6-CMV-carabin-shRNA和pHBAd-BHG质粒共转染293A细胞,以包装Ad-carabin-shRNA,采用微量全细胞病变法检测病毒滴度。Ad-carabin-shRNA感染H9C2心肌细胞,实时荧光定量PCR和Western blotting检测carabin mRNA及蛋白表达。结果:3个ADV4-U6-CMV-carabin-shRNA干扰质粒构建成功,相对应的Ad-carabin-shRNA包装顺利,病毒滴度均为9×108 TU/mL。感染H9C2心肌细胞后,Ad-carabin-shRNA-1和Ad-carabin-shRNA-2均有显著干扰效果,carabin mRNA和蛋白表达明显下调(P<0.01)。结论:Ad-carabin-shRNA构建成功,在心肌细胞中具有干扰carabin的效应。