摘要：猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophage,PAM)是包括猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)在内的多种高致病病毒的受体细胞,是研究病毒与宿主互作机制的重要模型。然而PAM来源有限,难以满足当前需求。利用猪诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)向巨噬细胞定向诱导是解决PAM细胞数量不足的有效方法。cd163是PAM细胞的重要标记,也是PRRSV等病毒的主要受体。建立实时报告cd163激活程度的报告系统对于建立并优化猪iPSCs向PAM的诱导分化体系具有指导意义。本研究利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑系统,设计靶向cd163终止密码子的sgRNA并构建相应的打靶载体,将其导入到猪PAM中的检测报告系统。进一步将该报告系统导入猪iPSCs中,通过碱性磷酸酶染色、免疫荧光染色和EDU染色等手段来检测其安全性。将猪内源cd163的报告载体系统转染至原代PAM中,检测到了红色荧光的表达,证明了该载体系统的可靠性;将cd163-reporter系统转染至猪iPSCs中,获得cd163 reporter-iPSCs。结果表明,cd163 reporter-iPSCs可以维持正常的多能性基因的表达,并具有与正常猪iPSCs一致的克隆形态和增殖能力。证实成功构建了cd163的报告载体,并将其转染至猪iPSCs,获得含有cd163报告载体的猪iPSCs系。该报告载体既不影响猪iPSCs的多能性,又能够实时指示cd163的表达,为深入解析猪iPSCs分化为PAM的机制以及解析PRRSV等重大病原与宿主的互作研究奠定了基础。

摘要：【目的】试验旨在利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得cd 163(cluster of differentiation 163)单等位基因表达的永生化猪肺泡巨噬细胞系(immortalized porcine alveolar macrophages,iPAMs),并探究其介导猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染的特征,为深入研究cd 163基因在PRRSV感染中的作用机制奠定基础。【方法】在猪cd 163基因外显子1区域设计8条向导RNA(single guide RNA,sgRNA),并将其连接到pX458载体中,通过T7E1酶切试验检测不同sgRNA载体的活性;将活性较高的3条sgRNAs表达载体电转染到iPAMs中,通过流式细胞术分选单克隆细胞,对获得的单克隆细胞进行基因型鉴定、蛋白表达检测、脱靶分析以及PRRSV感染分析。【结果】在设计的8条sgRNAs中有3条基因编辑效率在28%以上。基因型鉴定结果表明,50株片段敲除的单克隆细胞中有4株符合预期的cd 163单等位基因表达的iPAMs,效率为8%。蛋白表达检测和脱靶分析结果显示,cd 163单等位基因表达的iPAMs中cd163蛋白表达量显著下降(P0.05)。【结论】本研究利用CRISPR/Cas9编辑系统构建了可以正常感染PPRSV的cd 163单等位基因表达的iPAMs,为阐明cd163在猪繁殖与呼吸综合征传染病中所起的作用以及培育抗病猪新品种奠定了基础。

摘要：试验旨在构建一株高效表达猪cd163(pcd163)的Marc-145细胞系,为猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的临床分离和疫苗生产奠定基础。根据GenBank中序列设计引物从猪肺泡巨噬细胞(PAM)中扩增pcd163基因,将其插入真核表达载体pCI-neo构建真核表达质粒pCIpcd163,将该重组质粒转染Marc-145细胞,通过G418筛选、单克隆化并扩大培养筛选获得表达pcd163的Marc-145细胞系,IFA、Western blotting鉴定其表达情况。IFA结果显示,构建的pcd163-Marc细胞系中荧光明显亮于普通Marc-145细胞;Western blotting结果显示,pcd163-Marc细胞系中cd163蛋白表达量约为对照Marc-145细胞中cd163蛋白表达量的8.7倍。且该细胞系可稳定传至20代,各代次之间表达量无差异。证明高效表达猪cd163的Marc-145细胞系构建成功。

摘要：为了探索猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)细胞受体cd163在宿主感染PRRSV过程中的表达情况,根据cd163的序列在其保守区设计了1对特异性引物,基于SYBR GreenⅠ荧光染料建立了一步法检测cd163的实时荧光定量RT-PCR(real time RT-PCR)法,并对该方法进行了特异性、敏感性、重复性试验及样品检测试验。结果表明:建立的方法具有较高的特异性,PRRSV的其他几个受体(cd151、HS)均为阴性反应;对cd163的检测下线为10个拷贝数的模板RNA,比常规RT-PCR方法的灵敏度高10倍;对样品进行3次组内和组间重复试验,变异系数(CV)<2%,具有较好的重复性和稳定性;利用该方法对PRRSV感染Marc-145细胞后不同时间段cd163的转录水平进行检测,结果显示cd163在48小时时的mRNA含量明显高于其他各时间段。说明所建立的针对cd163的检测方法完全可以应用于临床样品的检测。

摘要：猪繁殖与呼吸综合征是危害养猪业重要传染病之一,cd163是猪繁殖与呼吸综合征感染易感细胞受体之一。从Marc-145细胞克隆出cd163基因并测序,再根据得到序列,应用Primer5.0软件设计引物,成功地扩增出带酶切位点cd163 ORF基因,通过HindⅢ和XhoⅠ双酶切位点将cd163基因克隆入真核表达载体pcdNA3.1-myc-His中,获得重组质粒pcdNA3.1-cd163,并将重组质粒pcdNA3.1-cd163在BHK细胞上进行表达鉴定。结果表明,Marc-145细胞cd163蛋白在BHK细胞中得到了表达。这为进一步研究cd163受体在PRRSV感染Marc-145细胞过程中作用以及与其他受体之间相互作用提供试验数据。

摘要：Objective: The purpose of this study was to evaluate the relationship between serum concentrations of relaxin and soluble cd163 with cervical length and preterm delivery in women with previous spontaneous preterm delivery. Study design: Sixty-one of 69 pregnant women with a previous spontaneous preterm had serum relaxin and soluble cd163 measured at week 16(range, 12-25 weeks). End points were cervical length and gestational age at delivery. Results: Of the 61 women, 26%had > 1 previous spontaneous preterm delivery; 84%were black; 87%were unmarried; 13%were smokers, and 39%were delivered before 37 weeks of gestation. Neither relaxin(median, 368 ng/L; range, 83-1493 ng/L) nor soluble cd163(2.4 mg/L; range, 0.86-6.85 mg/L) correlated with cervical length or gestational age at delivery. Black women had higher relaxin levels(436 vs 205 ng/L; P=.002), but soluble cd163 levels were similar among racial groups. Conclusion: Relaxin and soluble cd163 measured at 16 weeks of gestation are not clinically useful predictors of short cervical length or preterm delivery in women with a previous spontaneous preterm delivery.

摘要：为原核表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)受体cd163,本研究根据cd163基因序列(EU016226),通过生物信息学软件Scanprosite预测了cd163结构特征并进行分段。利用DNAstar软件设计合成3对特异引物,从猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages,PAM)中克隆cd163三个片段,经测序鉴定正确后,分别克隆于原核表达载体pET-28a(+),在IPTG诱导下,进行cd163重组蛋白的截短表达,经Western杂交检测证实表达的三段截短蛋白均具有良好的与抗原反应活性,从而为进一步研究cd163受体在病毒感染过程中的作用以及与其他受体之间的相互作用提供实验依据。